气相色谱法同时测定鱼腥草中4种化学成分

气相色谱法同时测定鱼腥草中4种化学成分

鱼粪草是一种一级植物。这是三白草科的一种干燥的草。茎和叶在清洗后会有鱼粪的味道，因此被称为鱼粪草。其味辛,性凉,归肺经,具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效,有效成分主要为挥发油和黄酮类物质。鱼腥草主要分布于中国中部、东南及西南各省区,目前在云南、贵州、四川等地栽培较多,资源较丰富。鱼腥草药材的质量直接关系到其制剂的质量,目前对挥发油中甲基正壬酮含量的研究有较多报道,但甲基正壬酮不能代表鱼腥草的所有有效成分,且甲基正壬酮不稳定在高温时容易分解,因此有必要建立多个有效成分含量的分析方法来全面控制鱼腥草的质量,α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮(化学结构式见图1)是鱼腥草中具有较高药用价值的活性成分,其含量是衡量鱼腥草药用价值的重要指标。所以作者采用气相色谱法对人工栽培的鱼腥草干品挥发油中的α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮进行了含量测定,所建立的方法操作简便快速、灵敏度高、重现性好,为鱼腥草干品的质量控制提供参考。1仪器、试剂与仪器Agilent-7890气相色谱仪、HPCORE色谱工作站(日本岛津公司),BP210S电子天平(德国Sartorius公司),AB135-S十万分之一天平(瑞士METTLERTOLEDO仪器有限公司)。α-蒎烯、β-蒎烯对照品(上海友思生物技术公司),甲基正壬酮、乙酸龙脑酯(中国药品生物制品检定所),十一碳烯(美国FLUKA公司),正己烷(色谱纯,天津博迪化工有限公司)。收集鱼腥草共7批,产地见表1,经沈阳药科大学中药学院贾英副教授鉴定为三白草科蕺菜属蕺菜(HouttuyniacordataThunb.)的干燥全草。2方法和结果2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液的测定分别取α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮对照品适量,精密称定。加正己烷溶解并稀释成质量浓度分别为26.1、19.52、32.1、15.1g·L-1的系列对照溶液。2.1.2内标溶液的制备称取十一碳烯对照品适量,精密称定。置5mL量瓶中,加正己烷溶解并稀释至刻度,制成质量浓度为9.70g·L-1的内标溶液。2.1.3挥发油的提取取各批药材约100g,精密称定。按《中华人民共和国药典》2010年版(一部)附录XD甲法提取各样品的挥发油,加适量无水硫酸钠脱水,振摇,静置。将脱水后的挥发油置2mL量瓶中,加入9.70g·L-1的内标溶液0.1mL,加正己烷溶解并稀释至刻度,摇匀,即得样品溶液。2.2子化分离器色谱柱:HP-5石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm);检测器:氢火焰离子化检测器(FID);进样口温度:250℃;检测器温度:280℃;程序升温:起始75℃、保持5min,以2℃·min-1升至90℃后保持2min,以20℃·min-1升至125℃后保持5min;载气:氮气;流速:1.0mL·min-1;进样方式:分流,分流比为10∶1。2.3空白溶液不干扰供试品测定按“2.1.3”条方法制备空白溶液。精密吸取空白溶液、对照溶液与供试溶液各1μL分别注入气相色谱仪,按“2.2”条色谱条件测定。结果表明空白溶液不干扰供试品测定;内标(S)、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮的保留时间分别为12.16、6.22、7.53、19.44、19.71min。空白溶液、对照溶液及供试溶液色谱图见图2。2.4仪器精密度试验精密吸取供试溶液1μL,按“2.2”条色谱条件测定,连续测定6次。以α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮与内标峰面积(Ai/As)的比值计算相对标准偏差,结果RSD分别为0.6%、0.6%、0.8%、1.3%,表明仪器的精密度良好。2.54h时间点各进样分析取同一供试溶液(产地山东),于室温避光条件下放置,于0、2、4、8、12、24h时间点分别进样分析。以α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮与内标峰面积(Ai/As)的比值计算,RSD分别为1.0%、0.7%、2.9%、2.2%,表明供试溶液在室温避光条件下24h内稳定。2.6测定取同一批号(产地山东)药材6份,按“2.1.3”条方法制备供试溶液,按“2.2”条色谱条件测定。计算α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮含量的RSD分别为1.3%、1.1%、3.0%、1.7%,表明方法的重复性良好。2.7标准工作曲线方程分别取α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮对照溶液0.4、1、0.7、5mL置于10mL量瓶中,移液管定容制成混合对照溶液。分别精密吸取混合对照溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.5mL置2mL量瓶中,精密加入内标溶液0.1mL,用正己烷稀释至刻度,摇匀,进样1μL测定。以各对照溶液质量浓度(ρ,g·L-1)为横坐标,以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标(Y),绘制标准工作曲线。结果α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮质量浓度分别在0.052~0.783g·L-1、0.097~1.464g·L-1、0.112~1.685g·L-1、0.377~5.663g·L-1内呈良好线性关系。所得回归曲线方程分别为:α-蒎烯Y=2.289ρ+1.98×10-2,R2=0.9991;β-蒎烯Y=2.353ρ+3.92×10-2,R2=0.9991;乙酸龙脑酯Y=1.932ρ+5.03×10-2,R2=0.9992;甲基正壬酮Y=1.873ρ+0.1264,R=0.9990。2.8供试溶液的制备称取已知含量的同一批号(产地山东)的鱼腥草药材共9份,按“2.1.3”条方法制备供试溶液。按低、中、高3个质量浓度分别精密加入对照溶液,每一质量浓度3份,按“2.2”条色谱条件进样分析,计算回收率。结果见表2。2.9鱼腥草中-烯、-烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮含量的测定取鱼腥草药材粉末约100g,精密称定。按“2.1.3”条方法制备供试溶液,按“2.2”条色谱条件进行分析,用内标对比法计算鱼腥草中α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮的含量。结果见表3。2.10所测化学数据的标准化处理由表3可知,不同产地不同来源的鱼腥草中主要化学成分含量相差较大,且甲基正壬酮的含量相对较高,因此作者以α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮和4种成分的总量为考察指标,对所测的化学数据进行标准化处理。选用类间平均连锁法(between-groupslinkage)进行聚类,系统聚类分析结果见图3。由图3可见,四川产地的鱼腥草挥发油中,4种成分的含量均较高,且高于其他6个产地的产品,可见购于四川的鱼腥草药材质量较好。3提取与鱼腥草相关的成分a.据《新编中药志》报道,鱼腥草挥发油的主要成分为:鱼腥草素(癸酰乙醛)、甲基正壬酮、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸龙脑酯及月桂烯、柠檬烯等,而作者采用《中华人民共和国药典》中的挥发油提取方法在干品鱼腥草中没有发现鱼腥草素及柠檬烯,这可能与鱼腥草干燥被空气氧化后,其中有些成分少未能检测到有关,如鱼腥草素被空气氧化成癸酰乙酸再降解成甲基正壬酮。此外作者是用干燥的鱼腥草提取的,其储存条件、产地、采摘时间、加工工艺的不同也会造成各产地的鱼腥草中其挥发油的含量有较大的差异。b.实验考察的7批鱼腥草中,只有山东收集的鱼腥草干品甲基正壬酮的含量较低,其余6批甲基正壬酮的含量相对较高,而于沈阳购买的湖北产鱼腥草所测的4种成分的含量相差最小,与新鲜鱼腥草中所测得4种成分含量大小接近。实验中还