胶体磨包合冬虫夏草的工艺研究

胶体磨包合冬虫夏草的工艺研究

活血止痛胶囊具有活血、祛瘀、止痛的功能。这是临床常用的中药。冰片在处方中作为佐使之药,起开窍醒神、清热止痛的功效,中医理论认为其走窜力强,具有辅助药性的作用,“独行则势弱,佐使则有功”,可以“引药上行”。现代药理学研究表明,冰片不但具有抗炎、抗菌、止痛的作用,还可以促进药物透皮吸收,促进药物透过血脑屏障,促进提高药物体内浓度。但是冰片沸点低,室温即升华,原工艺将冰片粉碎成细粉直接加入,灌装胶囊,冰片损失量较大。并且药物在储存的过程中也存在着冰片逸失而影响药物质量的问题。使用β-环糊精将冰片包合,可以大大提高其稳定性,减少在制剂和贮存过程中的损失。常用的饱和水溶液快速搅拌法包合温度高、时间长,包合效果欠佳,超声等其他方法的包合效果与快速搅拌法相似,而采用胶体磨碾法包合,具有包合温度低、时间短、包合率高、产量高等优点。本文对该方法包合冰片的工艺进行了研究,并采用气相色谱法将β-环糊精对有效成分龙脑的包合效果列为指标,评价包合工艺的优劣,为生产及质量控制提供了更加准确而可靠的实验依据。1仪器、试剂和试药TM-40胶体磨,天津市鑫普机械制造有限公司;GC-14B,日本岛津;N-2000双通道色谱工作站,浙江大学智能信息工程研究所;KQ-250DB型数控超声波清洗器,昆山市超生仪器有限公司;DZF-1B型真空干燥箱,上海跃进医疗器械厂;LXJⅡ型离心沉淀机,上海医疗器械三厂。龙脑:株州松本林化有限公司,含量为99.6%;冰片化学对照品:中国药品生物制品检定所,批号:742-8902;β-环糊精:中国医药集团上海化学试剂公司,批号T20030603;其他试剂为分析纯。冰片:购自株州松本林化有限公司,经鉴定符合2005年版《中国药典》一部冰片项下之规定。2方法和结果2.1包组分中龙脑含量的测定2.1.1高水势,低柱温度,现有火炬系统,理论塔板数,集料,2,低柱滤料,5,55;理论塔板数,以龙脑计,2020FID检测器,FEG-20M毛细管柱30m×0.53mm,固定膜厚度1μm,柱温120℃,进样口温度210℃,检测器温度230℃,载气为N2,N2压强75KPa,H2压强50KPa,空气50KPa,分流比1∶5,理论塔板数(以龙脑计)4600,分离度2.109,拖尾因子1.044。2.1.2溶液的制备精密称取水杨酸甲酯适量,加入乙醇,制成1mg/ml的内标溶液备用。精密称取龙脑适量,用乙醇溶解,配制成1mg/ml的龙脑标准品溶液,取2ml置于10ml量瓶中,加入内标溶液2ml,用乙醇稀释至刻度,混匀,即为对照品溶液。2.1.3供试品溶液的制备精密称取代测包合物样品适量,置于10ml量瓶中,加入内标溶液2ml,用无水乙醇稀释至刻度,摇匀,超声20min,冷却至室温,定容,过滤,即为供试品溶液。2.1.4线性关系的考察精密量取2.1.3项下龙脑标准品溶液0.2ml、1ml、2ml、4ml、6ml置于10ml量瓶中,加入内标溶液2ml,用乙醇稀释至刻度,混匀,各样品量取1μl进样,记录峰面积,以龙脑峰面积与水杨酸甲酯峰面积比值为纵坐标,以进样浓度为横坐标进行线性回归,得回归方程为:Y=-0.0368+6.68407X,r=0.9999,表明龙脑在0.02mg/ml～0.6mg/ml间有良好线性关系。2.1.5峰面积测定分别精密吸取对照品溶液1μl,连续进样6次,测定峰面积,计算比值峰别1.423、1.429、1.431、1.416、1.422、1.4303,RSD=0.41%。2.1.6龙脑平均含量取正交试验第7号样品,按照2.1.3项下操作,平行重复5次,进样测定(6.82%、6.71%、6.79%、6.85%、6.96%),龙脑平均含量为6.826%,RSD=1.34%。2.1.7稳定性测定取正交试验第7号样品,按照2.1.3项下方法操作,放置0h、3h、6h、12h、24h进行测定,龙脑含量分别为0.06825%、0.06794%、0.06812%、0.06790%、0.06877%,RSD=0.51%,结果表明溶液在24h内稳定性良好。2.1.8加标回收率试验取已知含量的正交试验7号样品,按测定含量时取样量的50%精确称量,加入适量龙脑标准溶液和2ml内标,按照2.1.3项下处理样品,测定并计算回收率,98.34%、96.31%、97.04%、98.21%、97.48%、95.84%,RSD=1.04%。2.1.9龙脑含量测定采用2.1.2项下龙脑标准品溶液配制方法,配制冰片待溶液,连续进样三次,测得冰片中龙脑含量为62.69%、62.84%、62.21%,平均含量为62.58%。2.2胶体磨合与婆罗洲正交试验2.2.1开动机磨包合物的制备按照正交表的安排,取一定量的β-CD,加入规定倍量的水研匀,倒入胶体磨中,开动机器(3000r/min),调节磨间距为5μm,缓慢连续滴加用适量乙醇溶解的冰片,碾磨一定时间,于40℃真空干燥24小时,用适量乙醇洗涤3次,40℃回风干燥,即得包合物。2.2.2包合物的筛选通过预实验考察,影响碾磨法包合效果的主要因素有:冰片与β-CD的摩尔比例、包合时间和加水量3个因素,因此采用L9(34)正交设计,以包合物中龙脑含量和龙脑利用率为评价指标,并采用综合评分法,龙脑含量和龙脑利用率权重系数分别为0.3和0.7,分析优选最佳工艺。因素及水平划分见表1,正交试验安排及结果见表2。龙脑含量和龙脑利用率计算公式如下:2.3龙脑利用率综合评价结果采用统计软件根据实验结果,对不同指标进行直观分析、方差分析和各因素水平的均值多重比较分析,并结合综合评分法检验分析结果,见表2～9。以包合物中龙脑含量为指标,极差分析可知各因素影响大小排列为A>C>B,A因素有显著性差异,其水平优劣排列为:2>1>3,其中2和3、1和3水平间有显著性差异,1和2水平间无显著性差异。B因素各水平间没有显著性差异,水平排列为:2>3>1。C因素水平排列顺序为2>3>1,其中3和1、2和1水平间有显著性差异,2和3水平间无显著性差异。以龙脑利用率为指标,分析实验结果,由极差分析可知,各因素对该指标影响大小的排列顺序为A>C>B,A因素有显著性影响,其水平优劣排列为:3>2>1,其中3和1、2和1水平间有显著性差异,3和2水平间无显著性差异。B因素各水平间没有显著性差异,水平排列为:3>2>1。C因素水平排列顺序为2>3>1,其中2和1、3和1水平间有显著性差异,2和3水平间无显著性差异。以包合物龙脑含量为指标的工艺为A2B2C2,以龙脑利用率为指标的工艺为A3B3C2。综合两个指标的分析结果,对于物料比例,由于两次不同指标的评价结果中1和3水平分别较差,且与其他两水平比较具有显著性差异,因此可以剔除,而选择2水平为最佳水平。对于碾磨时间2和3水平的比较中,两指标的评价结果均较好,且没有显著性差异,因此进一步比较二者不同指标下均差所占均值比例的大小,比值分别为:0.001682、0.003798,比值较大说明差异相对较大,该因素选择3水平。因此综合分析确定最佳工艺为A2B3C2。结合生产实际要求,赋予两指标不同权重系数:包合物龙脑含量0.3,龙脑利用率0.7,采用综合评分法进一步综合分析,并检验上述结果,见表7、表8。对综合评分结果统计分析,由极差分析可知,各因素对该指标影响大小的排列顺序为A>C>B,3个因素水平优劣排列依次为2>3>1、3>2>1、2>3>1,虽然A因素有显著性影响,但2和3水平间无显著性差异,因此,所得工艺为A2B3C2。又由水平分析表可知,B因素的2和3水平间没有显著性差异,且均差很小,结合生产的实际情况,缩短磨碾时间,选择A2B2C2为最佳工艺更为合理,符合生产实际要求。2.4磨尔比11、制备工艺验证试验对优化所得的最佳工艺A2B2C2,即物料磨尔比1∶1、碾磨时间40min、加水2倍量,进行3批验证试验,测定结果见表9,说明该工艺稳定可行。3包组分验证3.1醋酸乙酯提取液的制备称取包合物100mg,置具塞离心管中,加醋酸乙酯10ml,超声处理10min,离心(2500r/min)10min,倾出上清液,为醋酸乙酯提取液,备用;残渣加无水乙醇10ml,超声处理20min,离心(2500r/min)10min,倾出上清液,为无水乙醇提取液,备用。另取冰片对照药材10mg,加醋酸乙酯10ml溶解,作为对照品溶液,备用。取上述三种备用液依次点于同一硅胶G薄层板上,以正己烷-乙烷(8∶2)为展开剂,5%香草醛浓硫酸试液为显色剂,105℃烘至斑点显色清晰。在醋酸乙酯提取液色谱中没有斑点出现,而在无水乙醇提取液色谱中,与对照药材色谱相应的位置上,日光下显相同的2个蓝紫色斑点。可见包合物确已形成,并且包合前后主成分没有发生变化。3.2物相及物理混合物图谱DSC图谱显示,包合物在60℃处没有冰片的特征峰,而且在190.6℃有一个较强吸热峰出现,物理混合物图谱仅是冰片与β-环糊精峰的叠加,新的物相的生成说明包合物确已形成。4龙脑和异龙脑包合物的特性4.1胶体磨制备β-环糊精包合物的原理是依靠一对锥形转齿和定齿的相对运动,使物料通过可调节的间隙受到剪切、碾磨、搅拌、高频震荡,使包合客体与主体充分接触、撞击而进入β-环糊精空腔,达到包合效果。使用胶体磨制备β-环糊精包合物的产品得率高,包合时间短、温度低、产量大,占用空间小,工艺条件易控制,适合企业工业化大量生产。采用本工艺制备冰片β-环糊精包合物,龙脑的包合率可以达到99.44%,高于文献报道。使用胶体磨制备冰片β-环糊精包合物,在文献中尚未见有报道。4.2以往文献是将包合物收率和冰片的包合率设定为正交试验的评价指标,在测定过程中是以龙脑和异龙脑的总峰面积计算含量。而本文采用胶体磨制备β-环糊精包合物,不但收率高而且可控,因此未将其设定为评价包合工艺的指标,并且本试验首次采用了药效成分龙脑的利用率及其在包合物中的含量的为评价指标,这样既可以保证包合效果,又可以提高主药含量,使评价结果更加准确,同时也降低了β-环糊精的用量,达到节约成本的目的。在测定龙脑利用率的过程中,探讨了该测定方法的准确性和可靠性。4.3在测定龙脑利用率的过程中,笔者对文献报道的使用无水乙醇萃取和乙酸乙酯萃取使冰片包合物脱包的两种不同方法进行了比较,结果同一样品采用不同溶媒脱包的最终测定结果相差较大,前者为后者的1.4倍,验证了宋氏的试验结果。4.4本实验采用SPSS11.5软件包统计分析实验数据,在方差分析后用t检验完成各水平间的配对比较,进行均值多重分析,该方法可以直观地指示出因素各个水平间是否具有显著性差异及差异的大小,直观反应