气相色谱-质谱联用法测定鱼腥草挥发油中4种成分的含量

气相色谱-质谱联用法测定鱼腥草挥发油中4种成分的含量

鱼粪草是三白草科植物。别名:则耳根、猪鼻孔、鱼鳞草、九莲草等。具有清热解毒、消痈排脓、利尿等功效,有抗病毒、抗菌的作用。广泛分布于南方各省,主产于四川省、重庆市、贵州省、云南省等地区[2~4]。据文献报道,有学者采用GC法测定鱼腥草挥发油中甲基正壬酮的含量,另有学者采用GC/MS法分析鱼腥草挥发油中的成分,若仅以甲基正壬酮的含量作为鱼腥草质量评价的单一指标,却难以反映鱼腥草药材质量。本实验采用气相色谱—质谱联用法(GasChromatography-massSpectrometry,GC-MS),同时选择内标标准曲线法测定鲜品鱼腥草挥发性中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮4种成分,该方法快速简便、灵敏准确,为有效控制和评价鱼腥草质量提供一定的实验依据。1实验材料和设备1.1白草科植物菜材料采自什邡市回澜镇四川美大康中药材种植有限责任公司鱼腥草基地,经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为三白草科植物蕺菜Houttuyniacordatathumb.的新鲜地上部分。1.2仪器和试剂盒1.2.1仪器7890A/5975C安捷伦气质联用仪,安捷伦GC/MSD系统。1.2.2药品对照品甲基正壬酮对照品(批号:118034-200502)、乙酸龙脑酯对照品(批号:110759-200604)、α-松油醇对照品(批号:111859-201001)均购置于中国药品生物制品检定所;4-萜品醇对照品(江苏金坛市威德龙化学有限公司,纯度98.0%);正十一碳烯(东京化成工业株式会社,纯度>98.0%);正己烷为色谱纯;无水硫酸钠等其他试剂为分析纯。2方法和结果2.1气相色谱质量分析系统的适用性2.1.1序条件毛细管柱为HP-5弹性石英毛细管柱(30m×0.25m×250μm)。升温程序条件:70℃(持续5min),5℃/min,140℃(持续5min),10℃/min,250℃(持续10min)。进样口温度为230℃,载气为高纯He,流速为1.0mL·min-1;分流比为10∶1;进样量为1μL。2.1.2质量分析条件EI为70EV,四极杆温度为150℃,离子源温度为230℃。2.2溶液的制备2.2.1标准溶液的配制精密称取内标物质(正十一碳烯)0.20426g,置100mL容量瓶中,加溶剂(正己烷)稀释至刻度,配成2.0426mg·mL-1的溶液。2.2.2对照品贮备液的配制分别取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮适量,精密称定,加正己烷分别配成1.082、3.6574、6.064、2.0305mg·mL-1的贮备液,分别精密移取上述对照品储备液3、0.15、1、5mL置10mL量瓶中,加正己烷稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品贮备液,低温保存。2.2.3正己烷改性na2so4称取鲜品鱼腥草50g,剪碎,置500mL圆底烧瓶中。自挥发油测定器上端加蒸馏水150mL,再加正己烷1mL,连接回流冷凝管,加热至沸,保持微沸4h,停止加热,冷却至室温,取正己烷层,加无水Na2SO4约0.4g,振摇,除去水分,取上层溶液至10mL量瓶,并用适量正己烷洗涤无水Na2SO4,洗液并入同一量瓶中,精密加入0.5mL内标溶液,加正己烷定容至刻度,摇匀,即得。2.3方法学的检验2.3.1专属性试验结果按照2.1项下的色谱条件,分别测定空白溶剂、混合对照品与供试品溶液,结果显示对照品、内标及目标成分分离较好,无杂质影响,且其它成分也对测定无影响,表明该方法专属性良好(见图1)。2.3.2线性回归的测定分别精密量取混合对照品贮备液0.10、0.15、0.375、0.75、1.00、1.50、2.00mL,置5mL容量瓶中,精密加入0.25mL内标溶液,以正己烷定容至刻度。分别按照2.1项下色谱条件测定。再以A对照品/A内标为Y轴,以C对照品为X轴,进行线性回归。结果表明4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮分别在6.492~129.84μg·mL-1,1.097~21.944μg·mL-1,12.128~242.56μg·mL-1,84.76~169.52μg·mL-1范围内线性关系良好(见表1)。2.3.3仪器精密度试验精密吸取供试品溶液1μL,按照2.1项下色谱条件测定,连续进样6次,结果测得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮4种挥发性成分的峰面积与内标物峰面积比值(Ai/As)的RSD分别为0.58%、2.14%、1.52%、1.47%,表明仪器精密度良好。2.3.4重复性试验精密称取同一批号样品50g,称取6份,按照2.2.3项下供试品溶液配制方法制备,2.1项下色谱条件测定,结果测得4-萜品醇,α-松油醇,乙酸龙脑酯,甲基正壬酮4种挥发性成分的RSD分别为2.4%、1.5%、1.9%、2.3%,表明该方法重复性好。2.3.5挥发性成分检测取同一供试品溶液,室温下放置0、2、4、8、12、24h,按照“2.1”项下色谱条件测定,结果测得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮4种挥发性成分与内标峰面积比的RSD分别为0.58%、2.14%、1.52%、1.47%,表明在24h内供试品溶液稳定。2.3.6加样回收率试验称取已知4种成分含量的同一批鱼腥草鲜品药材25g,共取6份,分别适量加入各对照品贮备液,按照“2.2.3”项下供试品溶液配制方法制备供试品溶液,在“2.1”项下色谱条件测定,测得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮4种挥发性成分的平均回收率分别为81.2%、80.6%、88.3%、84.6%,RSD分别为1.5%、2.3%、1.1%、0.7%。2.4样品测定8批不同采收期鱼腥草鲜品挥发油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯、甲基正壬酮4种挥发性成分的含量测定结果见表2~5。3样品含量测定结果3种载气流速分别为0.5、1、2mL·min-1,结果表明载气流速为1mL·min-1时,峰型较好,完全出峰时间较短;3种分流方式分别为不分流、10∶1、20∶1,结果显示分流比为10∶1时,峰型较好,峰较多,基线较平稳。提取3、4、5h3个不同水平,结果显示提取4h和5h的挥发油提取率高,且提取完全,综合考虑时间、耗能等因素,提取时间为4h;加入2、3与4倍水3种不同料液比,结果显示加入3倍量水时挥发油提取效果好,效率高。2010版《中华人民共和国药典》(一部)对鱼腥草无定量测定,只有以甲基正壬酮作为指标的薄层鉴别。鱼腥草主要有效成分为挥发油,其组分复杂,虽有以单一成分为指标进行鱼腥草含量测定的文献报道,仍难以客观反映和评价鱼腥草的质量。因此,本实验首次建立了GC/MS法同时采用内标标准曲线法测定鱼腥草鲜品药材挥发油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龙脑酯和甲基正壬酮4种成分含量的方法。该方法采用多指标反映鱼腥草的质量,快速简便,灵敏准确,可为鲜鱼腥草的质量控制提供参考和依据。不同采收期