六味地黄丸的血清药物化学研究

六味地黄丸的血清药物化学研究

1989年，日本科学家田代真引入了“血清化合物”的概念。在此基础上,1994年日本学者鹿野美弘和我国学者王喜军、王莎莎等人发表了有关茵陈禽的血中移行成分及药代动力学、口服远志提取物后血清及胆汁中活性成分分析的研究论文,使血清药物化学的工作被真正付诸实践。此后王喜军等进行了大量血清药物化学的实践研究工作,1997年,发表了“中药及复方的血清药物化学研究”一文,正式提出了“中药血清药物化学”的概念及理论。六味地黄丸出自宋朝钱乙《小儿药证直诀》,由熟地、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓六味药材组成,是“滋阴补肾”之首方,现临床上广泛用于多种疾病的治疗。六味地黄丸研究表明口服六味地黄丸后从血中发现了11个人血成分,其中4个为新产生的代谢产物;7个成分为六味地黄丸体外所含成分的原型,其中有一成分虽为熟地中所含原型成分,但其他2种药材也能代谢产生,对其体内的量变有共同的贡献。现对六味地黄丸血清药物化学研究如下:1材料和方法1.1色谱数据的采集Agilent1100液相色谱仪,DAD检测器,含在线真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱。色谱数据的采集与处理由Agilent化学工作站完成。KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。1.2重质构与色谱熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻(经鉴定为正品),乙腈为美国Tedia公司产品(色谱纯);其余甲醇、正丁醇、磷酸均为分析纯。1.3动物健康SD大鼠(350±30)g,雌雄不限,由试验动物中心提供。1.4味地黄丸血清中成分的检测1.4.1空白血清及含药血清样品溶液的制备取健康SD大鼠,禁食12h(自由饮水),按照1.5ml/100g体重,分别灌胃给予蒸馏水,六味地黄丸,连续3d,第4d灌胃后1h摘眼球取血5ml,血液在3000r/min,条件下离心10min,取上清液lml,加人3m1甲醇,快速摇匀,3000r/min条件下离心30min,取上清液过0.2um微孔滤膜,备HPLC分析。1.4.2HPLC分析色谱条件KromasilC18,色谱柱(4.6mmX250,5um);柱温30℃;流速为0.8ml/min;检测波长280nm;流动相为甲醇-0.05%磷酸梯度洗脱;10:90,0-10min至20:80,10～30min至35:65,30～50min至50:50(保持30min)。1.4.3各生药谱峰与六味地黄丸谱峰的相关性研究以tRi表示某生药i(i=1.2,3......)的号峰的保留时间,tNi表示六味地黄丸指纹图谱中相匹配i的号峰的保留时间。以△t表示谱峰tRi与tsi的保留时间相对偏差,计算公式如下:以△t=(tRi—tNi)/tSi,该值越接近0,说明两谱峰的相关性越强。六味地黄丸及其血清中成分的分析,取10批六味地黄丸供试品溶液,以及3批六味地黄丸血清样品,在相同的色谱条件下进行HPLC分析,建立HPIC色谱图,比较分析确定进入血液的成分。并通过六味地黄丸及单味中药的血清样品的测定,对相应的色谱图进行比较分析,确定人血成分的来源药物。2味地黄丸与号峰的比较六味地黄丸给药后血清中出现了10个移行成分,与体外样品比较,其中8个为体外成分直接吸收入血,即1,2,3,5,6,7,8,10,号峰为六味地黄丸中所含的原型成分,且3号峰转运入血后的相对含量有较大的提高,而8号峰却明显下降;4,9,号峰为新产生的代谢产物。经与六味地黄丸、含药血清及单味生药比较分析确定入血成分的来源,同时根据保留时间和保留时间的相对偏差△t作为考察衡量各谱峰的相关性,得出1,2号峰来源于复方共同作用产生的,5,6号峰来源于熟地,3号谱峰来源于山茱萸、山药,8号峰来源于泽泻,7号峰来源于茯苓、牡丹皮,10号峰来源于牡丹皮、泽泻。3基于血清药物化学的血清中药成分分析本研究阐明了六味地黄丸的内部分化成分,并运用各峰谱的相关性作了一定的分析。其结果在某种程度上为阐明该方配伍机制及药效物质基础做出了实验基础。六味地黄丸给药后血中出现了10个移行成分,其中1,2号峰成分在六味地黄丸和熟地中含量均很低,但是吸收入血后此成分的相对含量大大提高,其来源于3种生药:熟地中含有此成分直接被吸收入血,而山茱英和泽泻中虽不含有此成分,但给药后血中也能产生该成分,复方中3种生药对同一入血成分的产生有共同贡献,表明了熟地配伍山茱英和泽泻的必要性。上述复方配伍规律的研究说明了经典方剂配伍的科学性及实际意义。血清药物化学的研究从人血成分这一研究对象入手是非常具有科学性的,但是在对复方配伍规律的具体研究中还存在其片面性,要将复杂的复方配伍规律较为科学的阐释,不能停留在体内少数特征成分的分析上,必须运用多学科的知识,如应用主成分分析、聚类分析、逐步回归分析等现代多元数据统计分析方法对配伍前后的血清指纹图谱的变化进行全面分析,并在此基础上对不同时间采血点的血清指纹图谱进行分析,找出整个入血成分谱在体内的经时变化过程,并且结合血清药理学的研究,对不同配伍入血成分组及不同时间点入血成分组与药效的变化进行相关性分析。中药血清药理学是将中药或复方经口给动物灌服一定时间后,采集动物血液,分离血清,用含药血清进行体外实验的一种方法。其无法确定最佳给药方案;无法做到体外培养体系内药物浓度与血药浓度相等又不影响组织、细胞生长;药效最佳的采血时间难以确定;血清成分复杂,不可控的影响因素太多,实验结果重复性差;血清本身固有的活性成分影响试验结果,无去除血清影响的理想措施。以上缺点的核心就是,血清药理学的方法仍然属于一种模糊的黑箱式操作,不能明确中药的入血成分,无法确定中药的药效物质基础。因此,血清药理学实验必须结合中药血清药物化学的研究结果,依据给药后入血成分数和量的变化规律,制定合理的给药及采血方案;依据血清色谱指纹图为指导,选择适当的方法去除血清中固有成分及内源性杂质,高度富集入血成分。任何药物都是通过与人体的相互作用而发挥疗效的。目前,绝大多数中药及其复方制剂仍然采用传统的口服给药方式,口服中药后血清中就含有真正的有效成分,即原形成分、代谢产物及机体产生的应激性成分。因此,通过分析口服给药后血清中成分来确定中药及其复方制剂的体内直接作用物质,将成为快速、准确地研究确定其药效物质基础的有效途径。通过中药血清药物化学研究,确定中药的体内直接作用物质,并以此为指标,应用高效液相色谱、气相色谱等技术,可建立国际标准化的定性定量方法,从而使中药及其复方制剂质