曲克芦丁对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响及其机理

曲克芦丁对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响及其机理

肝脏疾病的治疗和肝脏移植不可避免地会导致肝缺氧。重新注入肝脏会导致肝脏衰竭。药物预测是减轻i.r损伤的有效方法之一。芦丁(rutin)又名芸香苷,为一来源很广的黄酮类化合物。芦丁及其衍生物具有广泛的药理活性,具有降低毛细血管通透性、抗炎、抗病毒、镇痛、抗氧化及抑制醛糖还原酶等多方面作用。临床上主要用于防治脑出血、高血压、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等。文献上对芦丁在心脑血管疾病方面的作用机制研究和探讨较多,但其是否对肝脏的缺血再灌注损伤具有保护作用目前尚未见文献报道。本实验复制大鼠肝缺血再灌注损伤模型,并应用芦丁的可溶性羟乙基衍生物――曲克芦丁(Troxerutin)对动物进行术前预处理。测定各组大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的含量及肝组织中脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量,光镜检查肝细胞结构的形态学改变,观察曲克芦丁对大鼠肝脏I/R损伤的保护作用并探讨其作用机理。1材料和方法1.1大鼠肝心肌缺血量ld50实验动物与分组:成年健康Wistar大鼠30只,由山东大学医学院动物中心提供,体重(250±30)g,雌雄不限,随机分为3组,每组10只大鼠。①假手术对照组:(shamoperatedcontrol,SOC)常规手术和术后处理;②肝缺血再灌注组:(ischemia-reperfusion,I/R,模型组),夹闭肝固有动脉和门静脉30min后,再灌注120min;③曲克芦丁预处理组:(I/R+Troxerutin)术前腹腔内注射曲克芦丁20mg/kg,1次/d,连续3d,然后制作肝缺血再灌注损伤模型。1.2规格曲克芦丁注射液由山东华鲁制药有限公司生产(批号:A0507121;规格:60mg/支)。试剂:血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒,均购于南京建成生物工程研究所。1.3方法1.3.1肝蒂、肝组织分离各组动物均手术前12h禁食,不禁饮水。用1%戊巴比妥钠麻醉后固定于手术台上,常规脱毛、消毒、铺巾后,上腹正中切口,打开腹腔,分离出肝蒂,游离开肝固有动脉、门静脉和肝总管,用小血管夹同时夹闭肝固有动脉和门静脉,造成肝脏缺血。30min后取下血管夹恢复肝脏血供,再灌注120min后采集标本进行指标测定。1.3.2血清丙氨酸转氨酶alt和谷草转氨酶ast的活性测定分别以标准试剂盒(按照试剂盒说明书)测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性。1.3.3mda和sod含量测定颈椎脱臼法处死大鼠后,置于冰环境中,迅速切取肝组织,分析天平称取组织湿重,用蒸馏水混后制成匀浆,按MDA和SOD试剂盒操作程序进行测定MDA、SOD的含量。1.3.4组织病理学检测将大鼠以颈椎脱臼法处死后,快速取其肝组织,置于4%甲醛溶液中。将肝组织固定、脱水后,做石蜡切片,HE(苏木素-伊红)染色,用光学显微镜观察。1.4肝组织丙二醛、超氧化物歧化酶及sod含量测定各组动物血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性及肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量测定结果;各组大鼠肝组织病理形态学变化。1.5统计分析实验数据以x¯±sx¯±s表示,各组间差别的显著性用t检验判定。2结果2.1各组动物血清中的iv值和AST的含量及变化情况结果见表1。2.2各组动物肝组织中的mda含量和SOD活性的变化情况见表2。2.3优化拉医组细胞的排列和形态在光镜下观察各组肝组织HE染色的切片,可见对照组肝索排列规则,肝窦不扩张。缺血再灌注组肝细胞索排列较紊乱,肝细胞出现肿胀,空泡变性和点状坏死,汇管区有较多的炎性细胞浸润。曲克芦丁预处理组表现为肝索排列较规则,散在的肝细胞肿胀变化,肝细胞损伤程度和范围明显低于I/R组,汇管区炎性细胞浸润明显减少。3灌注期间抗氧化酶系统的变化随着肝脏外科的不断发展,肝脏多种疾病常需暂时阻断肝血流进行手术,结束时又需恢复肝血流,形成所谓“再灌注”。在对肝缺血尤其是缺血再灌注产生的细胞损伤及功能障碍机制的研究中,氧自由基的损害作用被认为是最重要的因素之一。据报道,肝缺血/再灌注损伤时血浆中脂质过氧化物的浓度与谷丙转氨酶活性呈密切正相关,并与肝形态学损伤的严重程度呈平行关系。肝缺血再灌注可从两方面为氧自由基的产生提供了条件:(1)缺血时,线粒体呼吸链功能失调,氧被非四价还原,生成活性氧自由基。缺血时,黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,后者在分子氧存在时(如再灌注时)催化次黄嘌呤(ATP分解的结果)代谢过程中,产生超氧自由基。(2)肝缺血再灌注期间,肝组织的代谢原料供应障碍及某些合成酶活性减弱导致SOD合成减少,以致氧自由基清除不足,血中氧自由基增多。超氧化阴离子转化形成的过氧化氢(H2O2)没被有效地清除,可以反过来抑制SOD活性,并且氧自由基可攻击酶蛋白改变对水解酶的敏感性而加速其水解,导致SOD活性进一步下降,内源性氧自由基清除剂SOD活性下降可导致氧自由基增多。再灌注时O2及金属离子供应增多,黄嘌呤氧化酶、中性粒细胞、线粒体及花生四烯酸等途径产生的氧自由基增多及SOD活性急剧下降而致的氧自由基清除下降,共同导致氧自由基明显增加。细胞膜系统富含脂质和蛋白质,膜脂是膜的基本骨架,在维持细胞的正常结构和功能方面起重要作用。肝缺血再灌注期间大量氧自由基的形成可攻击膜脂的主要成分是多聚不饱和脂肪酸,发生一系列氧化连锁反应,即脂质过氧化反应,造成肝细胞生物膜的严重损伤并形成脂质过氧化反应产物丙二醛(MDA)。随着细胞生物膜的损伤,亚细胞器的结构亦遭破坏,导致肝细胞损伤和血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)升高。文献报道,芦丁是一种天然的抗氧化剂,能对抗自由基活性,对O-2有很强的清除作用,其清除效率可达96%以上。芦丁作为Fe2+螯合剂,能抑制Fenton(芬顿)反应和脂质过氧化的链式反应而具有明显的抗脂质过氧化作用。芦丁还能够明显增强过氧化物歧化酶SOD的活性,提高清除自由基的活力。本实验表明,与对照组比较,I/R组各项检测指标都有显著性差异(P<0.01),表明造模成功。与I/R组比较,曲克芦丁预处理组大鼠血清中的ALT、AST活性显著降低(P<0.01),肝组织MDA的含量显