光激化学发光法检测血清甲胎蛋白的实验性能评价

光激化学发光法检测血清甲胎蛋白的实验性能评价

自半个世纪以来，临床化学微量免疫分析技术经历了放射免疫分析、酶联免疫分析和化学发光免疫分析的创新和质的飞跃。上世纪90年代问世的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术(luminescentoxygenchannelingimmunoassay,LOCI)具有均相、免清洗的技术特点,同时具有高敏感性和特异性等检测性能,应用范围涵盖了常规临床免疫分析、信号传导、受体配体分析、基因检测和新药开发等多个领域[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10]。国内研制成功了基于LOCI检测原理的光激化学发光法(lightinitiatedchemiluminescenceassay,LICA)检测设备和相关试剂。本研究拟对该方法检测血清甲胎蛋白(AFP)实验性能进行评价。材料和方法一、药品、试剂和仪器链霉亲和素(SA)包被的感光珠(60mg/L,批号148)、生物素化抗AFP抗体(20mg/L,批号66)、抗AFP抗体包被发光珠(300mg/L,批号149)、AFP定标品(0、6、22、122、480、1000μg/L,批号071211;标准参照物来源于中国药品生物制品检定所,批号150542-0004)、质控品(批号070829)、白色不透明微孔板(96孔和384孔)、光激化学发光检测仪(LICAHT)。以上试剂和设备均由博阳生物科技(上海)有限公司提供。实验用血清为上海市第六人民医院核医学科留存的临床患者检测标本。参比方法选用电化学发光免疫法AFP试剂及配套设备(Elecsys2010,Roche公司,德国)。二、线性结合体的能量生物素化抗AFP抗体、发光珠上包被的抗AFP抗体、待测标本或定标品或质控品中的抗原,三者形成双抗体夹心结构,加入SA包被的感光珠后,形成感光珠-发光珠紧密连接。感光珠受680nm激光照射使周围氧分子激发,变成单线态氧(singletoxygen,1ΔgO2,带有1个激发态电子的氧分子),后者扩散至发光珠并传递能量,发光珠发射520～620nm荧光信号并由发光检测仪探测。此过程中,单线态氧半衰期仅4μs,在反应体系中只能扩散大约200nm。故只有结合态发光珠才能获得单线态氧的能量而发光,非结合态发光珠由于相距较远,无法获得能量而不发光。发光信号强弱与夹心结构中AFP的量呈正相关,借助于定标品建立相应的函数关系,即可计算标本和质控品中AFP的浓度。三、光激化学发光仪待测标本或定标品或质控品、抗AFP抗体包被发光珠、生物素化抗AFP抗体各15μL加入微孔板,放入光激化学发光检测仪。仪器根据预先设定的程序进行混匀,37℃温育20min、加入SA包被感光珠60μL、37℃再温育15min,680nm激光激发1s,延迟60ms后在520～620nm波长范围进行光强度检测1s,显示标准曲线和标本检测结果等信息。四、实验的性能评价1.求平均相对光单位反求浓度rlu零浓度定标品(小牛血清)重复测量5次,求平均相对光单位(RLU),按“x¯+2sx¯+2s”在标准曲线上反求浓度。共检测2块微孔板。2.平均批内变异系数和总cv对低、高2个浓度质控血清连续检测11d,每天2批,每批各重复测量5次(其中1批重复10次),计算平均批内变异系数(CV)和总CV。3.标准曲线及回收率高浓度AFP血清(936.1μg/L)用零浓度小牛血清作1∶20、1∶50、1∶80、1∶95、1∶99系列稀释,各稀释点重复测量2次,取平均值作图,以各点实测平均浓度占期望值百分数计算回收率。五、lica和lica检测含AFP不同浓度的临床检测标本358份,分别用Elecsys2010电化学发光免疫法和LICA进行检测。根据前者分析敏感性0.61μg/L,后者0.25μg/L,更小的数值则分别记为“<0.61μg/L”或“<0.25μg/L”,为了能够进行统计运算,均按“0.61μg/L”(2例)或“0.25μg/L”(17例)计算。六、测量结果分析采用SPSS15.0统计软件,LICAAFP与Elecsys2010AFP测量值对数转换后进行配对t检验和直线相关与回归分析,对标本阴、阳性分组的一致性检验采用McNemar检验。结果一、检测曲线拟合LICAAFP各点定标品的发光值连续检测11d,每天2次,共检测22批次。曲线拟合采用3次样条插值函数,取均值后标准曲线见图1。图中误差棒代表“x¯±2sx¯±2s”。各标准点总CV为4.96%～8.44%,r=0.999～1.000。二、实验的性能评价1.反求浓度及反求浓度2块微孔板RLU的“x¯+2sx¯+2s”分别为1812和1922,反求浓度为0.22μg/L和0.27μg/L,平均值0.25μg/L。2.平均批内cv2个质控血清平均浓度分别为(10.69±0.43)μg/L和(499.97±15.85)μg/L。低值测量平均批内CV3.2%(1.1%～6.9%),总CV4.1%;高值测量平均批内CV1.8%(0.5%～3.2%),总CV3.2%。3.直线相关系数高浓度AFP血清系列稀释曲线见图2,直线相关系数(r)=-0.999(P<0.001),平均回收率为107.7%(97.4%～113.6%)。三、比较方法理论1.浓度的比较原始测量值不符合正态分布,取常用对数以后再进行配对t检验,结果差异无统计学意义(t=0.921,P=0.358)。2.gl的绘制散点图将2种方法测量值取常用对数后[Elecsys2010(LogE)和LICA(LogL)]在直角坐标系中绘制散点图,见图3。两者具有明显的直线相关趋势(r=0.966,P<0.001);直线回归方程为:LogE=0.233+0.737LogL(r2=0.933,方差分析F=4925.3,P<0.001,回归方程成立)。3.种检测方法对标本结果的影响Elecsys2010AFP正常参考值为≤7μg/L,当LICAAFP取正常参考值≤9μg/L时,2种检测方法对标本的阴、阳性分组结果差异无统计学意义(P=0.824)。只有20例(5.6%)分组不符,其中多数标本2种方法测量值非常接近,见图3的2、4象限散点(垂直线和水平线分别表示正常参考值的对数值:Log9和Log7),2种方法具有较好的一致性(Kappa=0.886,P<0.001)。检测结果和干扰物检测LICA检测原理源于LOCI技术,最初由Ullman等在1994年报道,后由PerkinElmer公司生产相关试剂(AlphaScreenTM)。该技术采用了纳米级颗粒,这不仅大大增加了生物分子的包被面积,同时借助于SA-生物素放大系统,使单位体积反应体系中含有更高浓度的生物分子,为实现超高敏感性、减少标本和试剂用量奠定了基础。另外,这种纳米颗粒在液相中保持稳定的悬浮状态,并借助于“结合则发光”原理,实现了均相、免清洗检测。Ullman等检测促甲状腺激素(TSH)的分析敏感性为1.9μU/L;批内CV为3.1%～5.2%,与传统化学发光法相关性好(r2>0.99)。Dafforn等将TSH标本用量由常规的80μL减少至10nL,敏感性仍可达到2pmol/L,为实现高通量、多项目和小型化芯片检测技术奠定了基础。该法对血清促绒毛膜性腺激素(HCG)的可测范围为0.1～100000IU/L,与传统化学发光法相关性好(r2=0.998)。检测肌红蛋白和肌钙蛋白I也达到较高的敏感性和理想的精密度。本研究对AFP检测结果显示,LICA较Elecsys2010敏感性高(0.25与0.61μg/L),并具有优越的精密度(总CV<5%)和良好的健全性(回收率97.4%～113.6%)。与Elecsys2010检测方法平行对比研究显示,两者不但具有较高的相关性(r=0.966),而且其检测浓度之间(P=0.358)及对标本阴、阳性分组(P=0.824)差异均无统计学意义,表现为良好的一致性(Kappa=0.886)。本研究未对血清干扰物进行研究。据文献报道,该方法对可能存在的干扰物质,如单线态氧淬灭物质(抗氧化剂、血红蛋白、维生素C等)、