左归丸含药血清对成骨细胞骨保护素、ranklmrna表达的影响

左归丸含药血清对成骨细胞骨保护素、ranklmrna表达的影响

近年来的研究表明，成骨细胞保护素（opg）-是打破骨细胞分化过程中重要的信号传导因素。在打破骨细胞生成、激活、激活和成熟过程中起着决定性作用。这是决定破骨细胞分化的非常重要因素。以往研究表明,左归丸对卵巢切除所致的骨质疏松症具有明显的治疗作用。实验采用原位杂交的方法,观察左归丸含药血清对体外培养成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达的影响,以期从细胞分子水平探讨左归丸治疗骨质疏松症的机制。1材料表面1.1实验动物及设备Wistar大鼠15只,雌性,体重200~220g,清洁级,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,实验动物合格证号:SCXK(军)2002-001。动物均在中国中医科学院基础理论研究所清洁级实验动物室内饲养,实验动物室许可证号:SYK11-00-0039。新生24h内Wistar乳鼠,由中国中医科学院基础理论研究所清洁级实验动物室提供。1.2水观点g,2.左归丸方药组成:熟地黄24g、山药12g、枸杞子12g、山萸肉12g、牛膝9g、莬丝子12g、龟甲胶12g、鹿角胶12g。常规水煎制浓缩,生药含量为5.88g/mL。此药物浓度按照人日用临床剂量(每日1剂,生药含量为105g/剂),经人-大鼠体表面积比值折算,浓缩8倍而成。1.3rangl靶基因的mrna分析DMEM培养基(美国Hyclone公司生产);新生牛血清(澳大利亚PAA公司生产);胰蛋白酶(美国Sigma公司生产);胶原酶Ⅱ型(美国Gibco公司生产);HEPES(美国Sigma公司生产);L-谷氨酰胺(美国Amresco公司生产);多聚赖氨酸(美国Sigma公司生产);青霉素、链霉素(国产);DAB显色试剂盒、大鼠OPG、RANKL原位杂交试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司生产)。大鼠OPG原位杂交试剂盒,采用针对OPG的寡核苷酸探针,经地高辛高效标记。针对大鼠、小鼠的OPG靶基因的mRNA序列为:①5′-TGGACAACCCAGGAAACCTTTCCTCCAAAA-3′;②5′-TTTGCCTGGGACCAAAGTGAATGCAGAGAG-3′;③5′-AGAAATGATAGGGAATCAGGTTCAATCAGT-3′。大鼠RANKL原位杂交试剂盒,采用针对RANKL的寡核苷酸探针,经地高辛高效标记。针对大鼠、小鼠的RANKL靶基因的mRNA序列为:①5′-GCCAGCCGAGACTACGGCAAGTACCTGCGC-3′;②5′-GGCCAGGTGGTCTGCAGCATCGCTCTGTTC-3′;③5′-TTTATAGAATCCTGAGACTCCATGAAAACG-3′。1.4仪器和分析方法超净工作台(JUJIKAGAKU,日本);RKI-100-B型CO2培养箱(RIKA-KOGYO,日本);倒置相差显微镜(日本奥林巴斯);DMIRB+Q500IMLEICA图像分析系统(德国莱卡公司);KQ-100E型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司);LXJ-6401离心机(北京医疗仪器修理厂);TDL-5-A电动离心机(上海安亭科学仪器厂)。2方法2.1左归丸含有药物的血清制备2.1.1动物组将15只雌性Wistar大鼠,随机分为正常对照组、卵巢切除组、卵巢切除加左归丸组,每组5只。2.1.2卵巢切除组血清卵巢切除组和卵巢切除加左归丸组,摘除大鼠的双侧卵巢。在术后3个月,卵巢切除加左归丸组大鼠灌服左归丸,2次/d,连续5次,于末次给药后1h,乙醚麻醉,无菌条件下,经腹主动脉采血,冷置1h后,离心(2500r/min,25min),分离血清,是为卵巢切除含药组血清,-20℃冰箱保存备用。卵巢切除组和正常对照组按以上程序,灌服等容积的蒸馏水,所取血清分别为卵巢切除组血清和正常对照组血清。2.2体外分离细胞的制备取新生24h内的Wistar乳鼠,拉颈处死置入盛有75%酒精的容器中,消毒5~10min,取出放入平皿中。于无菌条件下取出颅盖骨,放入4℃预冷的PBS(pH7.4)中,去除附着的骨膜及周围的结缔组织,PBS清洗2次,然后将洗净的颅盖骨剪成1mm×1mm小片,移入0.25%胰蛋白酶中37℃预消化15~20min,再将骨片移入另一含1g/LⅡ型胶原酶的溶液中37℃继续消化60min,使细胞从基质中解离出来。置上述胶原酶消化液于离心管中,1000r/min离心3min,弃上清,用DMEM培养液将沉淀洗1~2次后制成细胞悬液,重复以上步骤,将2次消化获得的细胞混匀,以终浓度1×109L-1接种于培养瓶内。在37℃、5%CO2培养箱中培养,24h后换液,除去未贴壁的细胞,以后2~3d换液1次。培养5~7d,细胞长成致密单层,铺满培养瓶底,即可进行传代。以0.25%胰蛋白酶使贴壁细胞消化松解,轻摇培养瓶,细胞即脱壁,以终浓度1×107L-1接种于培养瓶内,进行传代培养,取第3代细胞供实验用。2.3细胞悬液的制备实验分为3组:正常血清组、卵巢切除血清组、卵巢切除含药血清组,每组8个样本。取第3代成骨细胞,经胰酶消化,将细胞悬液以终浓度1×107L-1接种到培养皿中(预置多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片),24h细胞贴壁后换为含10%各组血清的培养液,培养72h后取出盖玻片,PBS冲洗3次,4%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.4),含有1/1000DEPC,室温固定15min,蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃保存备用。2.4原位杂交法检测mrna表达强度采用原位杂交的方法,检测OPG、RANKLmRNA在成骨细胞内的表达(用PBS代替杂交探针作为阴性对照)。细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,细胞长好后用0.1mol/LPBS(pH7.4)洗2min×3次;固定,用4%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.4),含有1/1000DEPC,室温固定15min,蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃保存备用;30%H2O2一份+纯甲醇50份混合,室温处理30min,蒸馏水洗涤3次;暴露mRNA核酸片断:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶,37℃消化90s,原位杂交用PBS洗5min×3次,蒸馏水洗1次;后固定,固定液为1%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.4),含有1/1000DEPC。室温固定10min,蒸馏水洗涤3次;预杂交,湿盒的准备:干的杂交盒底部加20%甘油20mL以保持湿度,恒温箱40℃孵育2~4h,吸去多余液体,不洗;杂交,将杂交液滴加在玻片上,恒温箱40℃过夜;杂交后洗涤,37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次;37℃0.5×SSC洗涤15min×1次;37℃0.2×SSC洗涤15min×1次;滴加封闭液,37℃30min,吸去多余液体,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60min,原位杂交用PBS洗5min×4次;滴加SABC,37℃20min,原位杂交用PBS洗5min×3次;滴加生物素化过氧化物酶,37℃20min,原位杂交用PBS洗5min×4次;DAB显色,使用DAB显色试剂盒。取1mL蒸馏水,加试剂盒中A、B、C试剂各1滴,混匀,加至标本上,室温显色,镜下控制反应时间,一般在20~30min之间,蒸馏水洗涤;脱水,透明,封片,光学显微镜观察。结果判断:成骨细胞阳性反应,细胞胞浆着色呈棕黄色,胞核阴性。形态计量学分析:所有标本进行原位杂交法染色后,每个标本随机选取5个视野(光镜下放大×100),用Leica图像分析系统检测OPG、RANKLmRNA表达的强度。结果以平均光密度值(MOD)表示。2.5统计方法实验结果皆以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,采用单因素方差分析(one-wayANOVA),组间两两比较,采用SNK法。3不同浓度卵巢切除血清中rakenlmna的表达卵巢切除血清组成骨细胞OPGmRNA表达的MOD值与正常血清组相比,显著降低。与卵巢切除血清组相比,卵巢切除含药血清组OPGmRNA表达的MOD值明显升高;而与正常血清组相比,无显著性差异。与正常血清组相比,卵巢切除血清组成骨细胞RANKLmRNA表达的MOD值明显升高。卵巢切除含药血清组与卵巢切除血清组比较,RANKLmRNA表达的MOD值明显降低;而与正常血清组比较,无显著性差异。说明卵巢切除血清组与正常血清组相比,成骨细胞OPGmRNA的表达显著下调,而RANKLmRNA表达明显上调;卵巢切除含药血清组与卵巢切除血清组相比,成骨细胞OPGmRNA的表达明显上调,RANKLmRNA的表达明显下调;而与正常血清组相比,无显著性差异。见表1。4左归丸含药血清对成骨细胞rakenl表达的调控RANKL是能直接刺激破骨细胞发育和使之激活的细胞因子,它与破骨细胞表面受体RANK结合,强有力促进破骨细胞的形成、分化、成熟,并抑制破骨细胞凋亡,延长其存活。RANKL对于破骨细胞的分化是必需的,在M-CSF存在的情况下,单纯给予RANKL即可刺激单核细胞前体形成抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性并具有骨吸收活性的多核巨细胞,这种作用不必有其他趋钙激素或细胞因子和成骨细胞的参与。此外,RANKL还可增强破骨细胞运动能力并抑制破骨细胞的凋亡而间接促进其骨吸收功能。实验采用原位杂交技术,观察成骨细胞表达RANKL的情况。结果显示,与正常血清组相比,卵巢切除血清组成骨细胞RANKLmRNA的表达明显上调;而在左归丸含药血清的作用下,成骨细胞RANKLmRNA的表达与卵巢切除血清组相比明显下调,而与正常血清组比较,无显著性差异。由此可以说明左归丸含药血清可能通过抑制成骨细胞表达RANKL,抑制了破骨细胞(OC)的活性,进而达到治疗骨质疏松的目的。OPG对破骨细胞的作用是多方面的,它可以抑制破骨细胞的分化、融合、激活,并促进破骨细胞凋亡。OPG通过与RANKL结合,竞争性抑制了RANKL与RANK的结合,而RANK是OC表面介导RANKL生物活性的唯一受体,所以可以特异性地抑制OC的分化和活性。研究证实,OPG与骨质疏松关系密切。在体外培养条件下,雌激素可使成骨细胞(OB)株分泌OPG增加3~4倍,提示绝经后雌激素水平下降进而影响OPG分泌与绝经后骨质疏松的发生有关。实验结果显示,卵巢切除血清组与正常血清组相比,成骨细胞OPGmRNA的表达明显下调;而在左归丸含药血清的作用下,成骨细胞OPGmRNA的表达与卵巢切除血清组相比明显上调,而与正常血清组比较,无显著性差异。由此可以说明左归丸含药血清可能是通过促进成骨细胞表达OPG,使之与RANKL的结合增多,抑制破骨细胞的功能,而达到治疗骨质疏松的目的。中医理论认为,肾藏精主骨生髓,骨的生长发育有赖于髓的濡养,骨髓充足,则骨就会变得坚固有力,骨髓缺乏,就会变得脆弱易折。实验结果说明,破骨细胞分化调控因子OPG、RANKL在“肾主骨”过程中起着非常重要的作用,当破骨细胞分化调控信号传导正常、使成骨细胞和破骨细胞处于正常的偶联状态促进骨形成时,就是中医骨髓充足的一种表现;而当破骨细胞分化调控信号传导异常,使成骨细胞和破骨细胞偶联