专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段

课题2

多聚酶链式反应扩增DNA片段课标领航1．尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作。2．理解PCR的原理和反应过程。3．讨论PCR的应用。【重点】

PCR的原理和反应过程。【难点】

PCR技术的操作过程。情境导引PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术，它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制，从而判,定疾病病原体的种类，所以从本,质上来说，这是一种分子诊断方法。

核心要点突破知能过关演练课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段基础自主梳理基础自主梳理一、PCR扩增的原理及条件1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2．原理(1)DNA的热变性：在80～100℃的温度范围内，DNA_________结构解体，双链分开，这个过程称为_____。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。多聚酶链式反应DNA双螺旋变性(2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。3．条件(1)______模板。(2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。(3)A、T、G、C四种______________。(4)耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。(5)需要稳定的_____和能严格控制_____的温控设备.引物DNA脱氧核苷酸pH温度思考感悟

1．什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特定的引物？【提示】所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。二、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为____、复性和延伸三步。1．变性：当温度上升到______以上时，双链DNA解聚为单链。2．复性：温度下降到_______左右，两种引物通过________________与两条单链DNA结合。3．延伸：温度上升到_____左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。变性90

℃50

℃碱基互补配对72

℃DNA聚合酶思考感悟

2．PCR循环过程中，变性温度设置95℃，时间设置30s的原因是什么？【提示】变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。三、实验操作1．实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控_____，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个___________代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行离心的场所。(3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。温度恒温水浴锅2．操作步骤准备→____→混合→_____→反应。

四、操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。2．所用的_________和酶应分装成小份，并在－20℃储存。五、DNA含量的测定1．原理：利用DNA在260nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。2．计算公式：DNA含量(μg)＝50×(260nm的读数)×_____________。移液离心高压灭菌缓冲液吸收稀释倍数核心要点突破要点一PCR原理1．PCR扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。2．PCR原理——DNA的热变性原理

通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。3．生物体内DNA复制与PCR反应的区别体内复制PCR反应解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行 (2011年聊城高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是(

)A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B．DNA复制不需要引物C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D．PCR扩增的对象是氨基酸序列【尝试解答】

__C__例1【解析】由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。【探规寻律】

(1)引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。(2)细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。跟踪训练

(2011年海淀区高二检测)关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是(

)A．加入的TaqDNA聚合酶耐高温B．不同大小DNA在电场中迁移速率不同C．此过程需要DNA连接酶D．扩增区域由两种引物来决定解析：选C。PCR扩增实验是在较高温度下进行的，故需要耐高温的TaqDNA聚合酶，但不需要DNA连接酶，A项正确，C项错误。因为不同大小的DNA带有不同数量的电荷，所以在电场中迁移速率不同，B项正确。PCR扩增需要两种引物，分别与DNA的两条模板链互补，则D项正确。要点二PCR反应的实验操作过程1．反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL注：①总体积50μL，②模板DNA的用量在1pg～1mg之间2.实验用具(1)PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸预变性94℃，5min－－30次94℃，30s

55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替，三个恒温水浴锅的温度分别为94℃、55℃和72℃，然后按照上表要求，在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL。(3)微量移液器：用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。3．实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上⇓用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各组分⇓盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁⇓将微量离心管放在离心机上，离心约10min⇓将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序 (2011年长春高二检测)多聚酶链式反应(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸等。反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，故DNA数以指数方式扩增，其简要过程如图所示。例2(1)某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A∶G∶T∶C＝1∶2∶3∶4，则经过PCR仪五次循环后，将产生________个DNA分子，其