辅酶Q10的发酵工艺设计

目录TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"前言 1\o"CurrentDocument"1菌种的选育 21.1菌种的选育及制备 2\o"CurrentDocument"1.2诱变育种 3\o"CurrentDocument"1.3菌种的保藏 5\o"CurrentDocument"2培养基的设计及灭菌 6\o"CurrentDocument"2.1培养基的类型及功能 6\o"CurrentDocument"2.2培养基的成分 6\o"CurrentDocument"2.3培养基的设计及优化 7\o"CurrentDocument"2.4培养基设计时注意的问题 82.5培养基灭菌 8\o"CurrentDocument"3空气灭菌 9\o"CurrentDocument"3.1过滤除菌流程及设备 9\o"CurrentDocument"3.2无菌空气的检查 11\o"CurrentDocument"3.3发酵罐灭菌 11\o"CurrentDocument"4种子的扩大培养 12\o"CurrentDocument"4.1实验室种子制备 12\o"CurrentDocument"4.2生产车间种子制备 12\o"CurrentDocument"5发酵过程的参数控制 13\o"CurrentDocument"5.1发酵过程的补料策略 13\o"CurrentDocument"5.2发酵过程pH值的控制 13\o"CurrentDocument"5.3发酵过程温度的控制 13\o"CurrentDocument"5.4溶氧的控制 14\o"CurrentDocument"5.5最佳接种量 14\o"CurrentDocument"5.6泡沫的影响及控制 14\o"CurrentDocument"5.7染菌的控制 14\o"CurrentDocument"6下游加工 156.1发酵液的预处理和固液分离 15\o"CurrentDocument"6.2细胞破碎及其碎片的分离 15\o"CurrentDocument"6.3辅酶Q10的提取与纯化 15\o"CurrentDocument"7物料衡算 16\o"CurrentDocument"8发酵罐的设计 17\o"CurrentDocument"8.1发酵罐的结构 17\o"CurrentDocument"8.2发酵罐的工艺尺寸 17\o"CurrentDocument"8.3通用式发酵罐的选择 189工艺流程图 20\o"CurrentDocument"参考文献 22前言辅酶Q又名泛醌，是一种脂溶性醌,其结构类似于维生素K,因其母核1010六位上的侧链一一聚异戊烯基的聚合度为 10而得名，是一种醌环类化合物。化学名2-（3,7,11,15,19,23,27,31,35,39-癸甲基—2,6,,14,1&22,26,30,34,38-四十癸烯基）-5,6—二甲氧基-3-10甲基-P-苯醌结构式辅酶Q分子结构10分子式CHO分子量863.3659 90 4辅酶Q受光照易分解，而受温度、湿度影响则较小。在室温下呈橙黄色结10晶物，是呼吸链上的一种递氢体，在自然界分布广泛。主要功能有自由基清除剂、抗肿瘤药物、增强免疫力、代谢激活剂，在细胞能量转换中具有重要作用、抗氧化作用、增强心脏对缺氧的忍耐力。辅酶Q10的生产方法有动植物组织提取法，化学合成法和微生物发酵法，化学合成法合成条件苛刻，步骤繁多；另外化学合成的辅酶Q10的异戊二烯单体大多为顺式结构，生物活性不好，且副产物含量多，提纯成本高。动植物组织提取法主要是从提取细胞色素C后的猪心残渣提取。动物组织中辅酶Q10含量低，每公斤新鲜猪心的收率仅为75mg，并受原材料和来源限制，规模化生产受到一定制约。微生物发酵法是目前认为最具发展前景的辅酶Q生产方法。该方法生产的辅酶Q产物活性好，可1010通过规模放大生产能力。其技术关键是辅酶Q产生菌的生产能力及分离纯化方法。10由于受菌种、发酵工艺以及下游提取的工艺的限制，微生物法生产得到的辅酶Q的10产量不高，目前还无法满足工业化生产的要求。通过诱变育种、构建工程菌、优化发酵工艺、优化提取纯化工艺等策略，能最大限度地提高辅酶Q的产量，有望实现10辅酶Q的工业化生产。101.菌种的选育1.1菌种的选育及制备优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。辅酶Q10产生菌及其细胞内含量辅酶Q10产生菌含量（mg/g干细胞）深红红螺菌5.4沼泽红假单胞菌3.9嗜硫小红卵菌3.6类球红细菌2.7荚膜红假单胞菌1.4黑粉菌0.2铜绿假单胞菌0.6掷胞酵母0.4新生隐球菌0.2从上表可以看出，光合细菌菌体中辅酶Q10的含量普遍较高。在分类地位上，光合细菌属于原核生物界细菌门真细菌纲红螺菌目，该目分为红螺菌和绿硫菌亚目，前者分为红硫菌科和红螺菌科。上述高产菌种大都属红螺菌科，因此红螺菌科细菌是产CoQlO菌种理想选择之一。红螺菌属细胞进行二分裂，革兰氏染色阴性。光和色素为细菌叶绿素a和螺菌黄素类类胡萝卜素。淡水菌种，生长不需要氯化钠，喜在光照厌氧条件下光异养生长，但也可在黑暗条件下微好氧或好氧生长，生长需要生长因子。本实验选择深红红螺菌作为生产用菌种，培养条件须为厌氧光照，有CO的存在。。菌种选育的一般步骤为：含微生物材料的选择——材料的预处理——所需菌种的分离——菌种的培养——菌落的选择——菌种初筛——菌种复筛——野生菌株——菌株保藏。1.1.1含微生物材料的选择由于红螺菌能进行光合作用，适宜生长在缺氧，光照充足的地方。广泛分布于江河、湖泊、海洋等水域环境中，尤其在有机物污染的积水处数量较多，故所取生物材料为污水处理厂的活性污泥。选好4到5处取样点，每处取1Og污泥样品，并混合放置在预先灭菌的容器中，记录好时间，地点和环境等情况，以备查考。材料的预处理将取得的样品放在缺氧、不含氯化钠、富含有机物的的条件下进行培养，并控制PH在接近中性的范围类，在厌氧条件下能进行光能异养生长的红螺菌科将逐渐占据优势地位，其他杂菌的生长将受到抑制。1.1.3所需菌种的分离可利用选择培养基对预处理后的材料进行富集液体培养，施加选择压力，在培养基中可以加入较多有机物，并且把葡萄糖作为碳源，在严格厌氧条件下进行培养，同时控制PH值在6.5与7.5之间，放置在光照充足的地方。这样红螺菌属将取得生长优势地位。然后可以用平板划线法进行菌种分离。方法如下：用接种管蘸取少量经增殖培养后的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻划线，划线时平板面与接种环成30°〜40°,以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得红螺菌野生菌株。菌种的培养将获得的菌株接种到半固体培养基上进行培养，培养基的配方为：1L蒸馏水，30g葡萄糖，10g蛋白胨，20g琼脂，20gNaHC0,0.5gMgS0・7HO,5gNaCl,IgNHCl；34240.5g酵母膏，生长因子lml,微量元素溶液lml，pH值为7.0。培养一段时间后，培养基上将出现大小不一的特征菌落。菌落的选择培养48h后，挑取比较大的浅红色菌落，常用的方法有铺菌法、复印平板法。菌落的筛选时选育过程中最耗时和最困难的步骤，所以应该采用合适的方法，减轻工作量。诱变育种由于野生型菌株生产性能较差，因此通常会对出发菌种进行诱变处理，从而选育出高产菌种。诱变育种可以利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合要求的个体，进而培育成新的品种。诱变剂包括物理、化学、生物诱变，在微生物诱变育种中，可用物理化学复合诱变因素处理菌种，扩大突变的位点范围，使获得正突变的菌株的可能性增大。因为不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前一般先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。高剂量会造成菌体致死率90%——99.9%%，可以获得较高的正突变；而低剂量致死率在70%——80%，甚至更低时，能够提高正突变率，但工作量大大增加。本设计中依据高剂量，高致死率标准，减轻工作量。诱变育种操作程序如下：出发菌株f纯化f培养液f细胞或抱子悬液f诱变剂处理f中间培养f平板分离f初筛f复筛f生产性能实验f菌种保藏。出发菌株的选择用来育种处理的起始菌株称为出发菌株。一般选择自然界分离的野生菌株、经历生产条件考验的菌株和经历多吃育种处理的菌株；其中经历生产考验的最好。本设计中选用分离到的野生菌株作为出发菌株。深红红螺菌菌悬液的制备在制备细菌悬液时通常选取处于对数生长期的细菌作为出发菌种，这类菌种对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大，所以要提前进行摇瓶培养，使细菌达到对数生长期。将菌株培养液用玻璃珠振荡以打散细胞团，再用脱脂棉花过滤，得到分散的菌体；本设计选用的深红红螺菌的菌悬液浓度应控制在108个/ml,菌悬液用生理盐水进行稀释，这样就得到了适宜进行诱变处理的菌悬液。对菌种的诱变处理取菌浓度为108个/ml的菌悬液5ml于直径6厘米的无菌培养皿中，磁力搅拌均匀，在功率15W的紫外光线下，距离30cm处进行紫外照射（经查找资料可知最佳照射时间为130S，致死率为95.9%,正突变率较高）。接着进行化学试剂诱变处理，本设计所采用的诱变剂为亚硝基胍。将存活下来的菌株活化培养后，取2ml培养液与亚硝基胍溶液混合制成一定菌浓的菌悬液，注意应加少量的磷酸，调节PH值接近中性，然后再将离心管放在摇床上振荡处理一段时间（经查找资料可知亚硝基胍处理的最佳浓度为0.2mg/ml，最佳处理时间为40min,致死率为96.94%）。40min后停止振荡，取下离心管用手充分振荡后，然后各吸取0.5ml的菌液依次进行涂布，注意应涂抹均匀。将涂布平板放置在32°C的培养箱中培养48h。挑选高产菌株并保种经培养后有菌落出现，每个菌落挑取少量菌体在250ml的三角瓶中分别进行摇瓶发酵培养，三角瓶中加入50ml的发酵培养基，培养时间为48h。然后对辅酶Q进10行提取，制成CoQi0提取液，利用紫外分光光度法，在275nm下测定提取液的吸光

度，再与标准曲线对照，计算出每个菌落菌体的CoQ产量，并与野生菌株的产量10进行比较，挑选出高产菌株并保种。在测定前，应先绘制CoQ的在275nm下的标准曲线，方法为：取已知浓度的10CoQ样品进行不同程度的稀释，然后测定275nm下的吸光度，以吸光度为纵坐标，10CoQ的浓度为横坐标，绘制成标准曲线。10辅酶Q的提取方法为：采用酸碱皂化法进行提取，将培养液在离心机中离心1015min,转速为5000r/min，收集菌体，用生理盐水洗涤2次，然后放在干燥箱中干

燥lh，可测得菌体重量。然后将菌体与乙醇、氢氧化钠、焦性没食子酸溶液混合制

成皂化液，皂化液再与石油醚混合进行萃取，再在低温减压条件下进行浓缩，浓缩

液与乙醚、石油醚混合进行吸附洗脱，洗脱液与无水乙醇混合溶解，制成CoQ的10粗提品。在与无水乙醇混合时每组应加入相同体积的乙醇。高产菌株的稳定性试验和菌种特性考察将所获得的高产菌株连续传代5次，并分别进行摇瓶发酵培养，测定其CoQ的10产量，观察其遗传稳定性，将具有稳定遗传特性的突变高产菌株保藏起来。菌种的保藏菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。在这里我们采用石蜡油封存法将菌种接种到固体斜面培养基上，培养36h后，然后缓缓注入一定量的灭过菌的石蜡油，用量要咼出斜面lcm,然后保存在4C的冰箱中，保存期一年左右。2培养基的设计及灭菌培养基的类型及功能培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。发酵培养基是供菌体生长、繁殖、和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又可以迅速合成所需产物。培养基的成分培养基的成分大致分为碳源、氮源、无机盐及微量元素、生长因子、促进剂和抑制剂、前体和水等几大类。对不同的微生物，微生物不同的生长阶段，不同的发酵产物以及不同发酵工艺条件等，所使用的培养基都是不同的，这些也都是培养基配制需要考虑的因素。碳源碳源主要为微生物细胞的生长繁殖提供能源、为合成菌体和产物提供所必需的碳成分。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳酸。本设计通过测定葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、玉米粉分别作为培养基碳源，其他成分不变时，深红红螺菌CoQ10单位产量的高低，确定了最佳碳源为葡萄糖，其次为麦芽糖。氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物，分为有机氮源和无机氮源。常用的有机氮源有花生饼粉、豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等；常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐、氨水，微生物对无机氮源的吸收较有机氮源快。通过实验得知对于深红红螺菌而言，有机氮源比无机氮源好，又通过比较酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、尿素、硝酸铵分别作为氮源时CoQ的单位产量，可确10定最佳氮源为酵母膏，其次为尿素、蛋白胨。无机盐类及微量元素微生物在生长和繁殖生长过程中，需要某些无机盐及微量元素如磷、镁、硫、钾、钠、钙、铁、锰、锌等，以其作为生理活性物质和调节物，这些物质一般在低浓度时有促进作用，在高浓度时起抑制作用。本设计研究了NaHCO、MgSO・7H0、342NaCl分别加入培养基后，CoQ产量的变化，均有助于产物的合成。10水水是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时水又是热的良好导体，有利于散热，可调节细胞温度。在CoQ的发酵生产中，为了避10免水质变化给生产带来不良影响，发酵用水采用深井水，并定期检查水质，要求pH在6.5〜7.5范围内。生长因子生长因子是微生物生长不可缺少的微量的有机物，它不是对于所有微生物都是必须的，有些微生物可以自己合成。有机氮源是生长因子的重要来源，最具代表性的是玉米浆。因子培养基中加入适量的玉米浆有助于产物产量的提高前体、产物促进剂和抑制剂前提物质可以被直接结合到产物分子中去，而其自身没有太大变化。通过研究辅酶Q的生物合成途径，在培养基中可以加入羟基苯甲酸、烟酸、酪氨酸、维生10素B1等前体有利于产物合成。产物促进剂指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但可以提高产量的添加剂。2.3培养基的设计及优化2.3.1培养基成分选择的原则在考虑某一菌种对培养基的总体要求时，选择成分时应注意：（1）菌体的同化能力，选取合适的碳源和氮源，（2）代谢的阻遏与诱导，适量加入有机氮源，（3）合适的C、N比，一般工业发酵培养基的碳氮比为100：(0.2——2.0),(4)pH的要求,发酵过程中，需要适宜的生长代谢环境。要保证pH能够满足生产要求，在配置培养基时应加入适量的缓冲液。本设计选用NH4Cl作为缓冲液，维持pH稳定，同时加入的NaHCO也可以作为缓冲液。32.3.2培养基的优化虽然培养基的最优成分已经确定，但各成分的适宜浓度往往需要通过实验确定，最终设计出一个合适的培养基。一个适宜的培养基必须满足产物最经济的合成，也就是原材料的利用率要高，转化率的要高。发酵过程的转化率一般有两个：一为理论转化率，二为实际转化率。理论转化率可以通得过反应方程式的物料衡算得出。实际转化率可以通过实验得出，培养基的最终成分和浓度也需要实验确定。一般通过单因子实验确定最佳成分，在前面已经确定；而最佳浓度一般通过多因子实验确定。对于多因子实验常采用的方法有：正交实验设计、响应面分析等。通过正交实验确定最适宜的碳氮源的组合，因为单一碳氮源的营养程度不如复合碳氮源，因此采用葡萄糖、麦芽糖为复合碳源，酵母膏、尿素为复合氮源，通过正交来优化各个参数，按4因素、3水平进行L9(34)实验，得到各组实验的结果后,通过确定K、R值后，对结果进行分析，确定最佳的碳氮源配比条件。查找资料可知最佳配比为葡萄糖20g/L、麦芽糖10g/L、酵母膏6g/L、尿素0.3g/L。然后利用相同的方法，也可以确定无机盐的适宜浓度。查找资料可知无机盐的最佳配比为：20g/LNaHCO、1g/LMgSO•7H0、5g/LNaCl。3 4 22.4培养基设计时注意的问题为了确保培养基的设计符合工业生产要求，应该注意(1)原材料及设备的预处理，所用的原材料有些必须经过适当的预处理。工业一般使用铁制发酵罐，培养液中就无需再加入含铁化合物也能满足生产要求。(2)原材料的选择原料都应该定点采购和加工(3)发酵特性的影响，应该注意产物合成受培养基性质的影响2.5培养基灭菌所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤灭菌等。本实验采用湿热灭菌，条件为在121°C（表压约O.IMPa）维持30min。湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌，是工业中最重要的灭菌方法。在同样的温度下，湿热的杀菌效果比干热好。湿热灭菌过程中蒸气放出大量热量，加速提高温度。因而湿热灭菌比干热所要温度低。如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短；而且蒸汽的穿透力大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。灭菌原理，对数残留定律：经湿热灭菌，微生物死亡速度和残存的微生物数量成正比。即-dN二kN,N为培养基中微生物的个数，工是微生物受热时间，s；k为比死亡dx速率，S-1.积分可得：In =-kx，N为经T时间灭菌后培养基中微生物数。N为培养基N 00中灭菌前中微生物数。一般取对热抵抗力较大的芽孢杆菌的k进行计算，经验公式为：lgk―14845+36.127或x=-lnN，N为灭菌结束时培养基中活微生物数，一T kNsS般取0.001个，N—般取107个/ml。通过以上过程即可算出培养基的灭菌时间。03空气灭菌由于深红红螺菌喜好在厌氧光照条件下生长，辅酶Q10产量较高，氧气存在时深红红螺菌也能够生长，但产物产量会略微下降，考虑到生产成本，若除去氧气会增加成本，所以采用有氧发酵发酵。-获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。过滤介质除菌是目前发酵工业中空气除菌的主要手段，其介质有棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、金属烧结管等。3.1过滤除菌流程及设备空气净化流程如下：采风塔f粗过滤器f空气压缩机f空气贮罐f冷却器f旋风分离器一冷却器一丝网除沫器一空气加热器一空气过滤器。设备如下：采风塔：采风塔建在工厂的上风头，远离烟囱，高至少10m，气流速度8m/s左右，也可做成采风室。2•粗过滤器：主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。过滤介质可选用泡沫塑料或无纺布，设计流速为0.1〜0.5m/s。3•空气压缩机：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。4•空气储罐：作用是消除压缩空气的脉动。要求：H/D=2〜2.5 Vr=（0.1〜0.2）V1其中，H为罐高；D为罐直径；V］为空压机每分钟排气量（20°C,1X105Pa状况下）。5•旋风分离器：是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子，对10卩m左右的粒子分离效率为：60%〜70%。分离器入口的设计流速w为15〜25m/s,主要尺寸为：直径D二 —g Ah'b'wD=0.5D;L=1.5D;L=2.5D;112b=0.25D;L=0.5D;L=0.5D;D=0.25D；h'=0.5;b'=0.2〜0.502若D大于0.8时，应采用多个分离器并联6.冷却器：空压机出口温度气温在120°C左右，必须冷却。另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。一般采用列管式热交换器。考虑到热的损失，选用换热器时，可将换热面积放大15%〜20%。换热面积为A=—Jm2。KAtm7•丝网除沫器：分离效率更高，可以出去1Mm以上的雾滴，一般采用规格为直径0.25mmX40孔且高度为100〜150mm的不锈钢丝网。本设备设计的关键是气体流速的选择和丝网虚密度的确定。气体流速为w=0.75ww=k丄g，pp分别d a；a飞p1、gg为液体、固体的密度；k一般取0.107空气加热器：一般用列管式换热器，列管内走空气，管外走蒸汽。可将空气湿度由100%降低到70%以下。总过滤器：本设计采用纤维及颗粒状介质过滤器，填充物按下面顺序安装：孔板f铁丝网f麻布织品f棉花T麻布织品T活性炭f麻布织品T棉花f麻布织品T铁丝网f孔板。介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的1/2,中间活性炭层为1/2,—般棉花的填充密度为150〜200kg/m3，活性炭为40〜450kg/m3。通过过滤器的气体流速一般为0.2〜0.3m/s.过滤器应预先灭菌，自上而下通入0.2〜0.4MPa的蒸汽，灭菌45min左右后用压缩空气吹干备用。无菌空气的检查现在采用的无菌检查实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。这里采用肉汤法，用装有酚红肉汤的无菌试管取样，37C培养，观察培养基颜色的变化，确认是否染菌。发酵罐灭菌发酵罐的灭菌可采用空罐灭菌和实罐灭菌，此处采用空罐灭菌，即把培养基与发酵罐分别灭菌。空罐灭菌是：关好空气阀门，蒸汽上进下出，冲蒸气，压力大于2kg/cm2（120°C），最好是4〜5kg/cm2（160C）。当罐内温度＞80C，进蒸汽口（蒸气阀）关掉，出蒸汽口（排气阀）关小。打开空气阀门，蒸汽直接进罐，121C，20〜30min。从80C〜100C上升很快，大于100C后温度上升很慢，至【」118C时就开始计时，到计时25min时立即关掉蒸汽阀。关掉蒸汽阀后通入无菌空气，使罐内一直保持正压（高于大气压，空气不会倒灌入罐内）。加自来水冷却，从下向上，使温度尽快降到55C左右，到37〜38C时关掉水，也有缓冲性。由于此次设计产量是50吨，所以冷却系统应采用冷却管系统，如列管换热器。4种子的扩大培养本发酵属于二级种子罐扩大培养，三级发酵。设计流程如下：抱子f锥形瓶f种子罐f种子罐f发酵罐4.1实验室种子制备将保藏在石蜡油中的菌种经无菌手续接入适合菌种生长的斜面培养基中。斜面培养基的配方为：葡萄糖20g/L、麦芽糖10g/L、酵母膏6g/L、尿素0.3g/L、20g/LNaHCO、1g/LMgSO・7H0、5g/LNaCl、1g/LNHCl，另外需加入适量的生长因3424子，pH在6.5〜7.5之间，培养温度控制在32度，培养48h，光照充足。斜面培养结束后，挑取菌落较大的菌体利用微孔接种法，接种到含液体培养基的摇瓶中进行扩大培养，获得菌丝体，作为种子。摇瓶装液量为50ml/250ml，液体培养基的配方为：葡萄糖1g、麦芽糖0.5g、酵母膏0.3g、尿素0.015g、1gNaHC0、30.05gMgSO・7H0、0.25gNaCl、0.05gNHCl，0.05ml的生长因子，pH为7左424右，培养温度为32度，培养时间为24h，光照充足。4.2生产车间种子制备一级中种子罐扩大培养；将摇瓶发酵的菌丝体利用火焰接种法，移种至种子罐继续扩大培养。32°C条件下，培养时间为16h。此时菌体处于生长旺盛的对数生长期。二级种子罐扩大培养；将一级种子罐的菌液用压差法，移至含有新鲜培养液的二级种子罐，根据经验，接种龄应为生命力极为旺盛的对数生长期，根据资料可知最佳接种量为10%，在32C下培养10h，菌丝迅速繁殖，此菌丝即可移种到发酵罐作为种子。发酵罐培养；将经过扩大培养的二级种子罐菌体接种到发酵罐中，方法为压差法，接种量为10%,发酵温度为32C，培养时间为72h，光照充足，发酵罐培养基的配方为：葡萄糖1.4%、麦芽糖0.7%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.8%、尿素0.04%、0.3%NaHCO、0.04%MgSO・7H0、0.2%NaCl、0.05%NHCl，调节pH至6.5〜34247.5。5发酵过程的参数控制5.1发酵过程的补料策略经过研究证明，对于辅酶Q而言，补料发酵比分批发酵的产率更高，产率提10高近一倍。考虑到辅酶Q的产量较低，且其产量与菌体生长为半偶联过程，产物10形成速率与菌量有关，与菌的生长速率无关，故采用补料分批发酵方式。在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂，以满足微生物的代谢活动和产酶的需要。最佳补料时间为发酵开始36h后，最佳补料方式为少量多次，每4h一次，以低浓度的碳源，高浓度的前体和氮源的培养基补料。5.2发酵过程pH值的控制各种微生物需要在一定的pH环境中方能正常生长繁殖。培养基中C/N比值高,发酵液倾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，发酵液倾向于中性或碱性，pH偏高。深红红螺菌为淡水菌种，经实验证明初始pH为7.0时最有利于辅酶Q的产生。因此,10在发酵过程中，可通过添加适量的尿素或NH4C1等来稳定pH。发酵过程温度的控制温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质。不同的菌种有着不同的最适温度。经过单因素实验可知最佳发酵温度为32°C，此温度下产量最高。溶氧的控制本设计的辅酶Q发酵是需氧发酵，研究表明，辅酶Q的合成与溶氧密切相关,1010通气不足会使产生NADPH的HMP途径受阻而使EMP途径增强，不利于辅酶Q的积10累。若发酵液中氧气不足，可通过加大通气量，适当降低温度，提高罐压，补水，提高搅拌速度来控制。最佳接种量若接种量过小，会使发酵周期增长，同时会增大染菌的机会，若接种量过大，会使培养液黏度增加，导致溶氧不住，影响产物合成。深红红螺菌的最佳接种量为10%，接种龄为对数生长期。泡沫的影响及控制由于通气搅拌、发酵产生的CO及发酵液中糖、蛋白质的存在，使发酵液含有2一定量的泡沫。泡沫可以增加气液接触面积，有利于氧气的传递，但大量泡沫的存在会带来很多副作用。工业上泡沫的控制方法有机械和消泡剂两种。考虑到后期产品的提取及生产菌种对溶氧要求不是很高，本设计采用机械消泡，采用灌外法消泡。染菌的控制在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量、重则倒罐或停产、影响工厂效益。因此要严格无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。可能出现的异常发酵现象：培养基变稀：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏；培养基过浓：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染；耗糖较慢：可能原因是种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷；pH值不正常：用缓冲对来调节，检查是否染杂菌，碳氮比是否合适；生长缓慢：最可能的原因就是营养成分不足。6下游加工下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵、反应液或培养液分离、精制有关产品的过程。下游加工过程的一般工艺流程为：■固体f细胞破碎f分离发酵液f预处理f固液分离 1二+液体f初步纯化f高度纯化f最后纯化f成品加工这一步主要目的在于改变发酵液的性质，以利于固液分离。方法有酸化、加热和加入絮凝剂。固液分离中，传统方法有板框压滤机和鼓式真空过滤机。通常的方法是：在鼓式真空过滤机转鼓的表面预先铺一层2〜10cm厚的助滤剂层，过滤时形成的滤饼不断地缓慢前进的刮刀，连同极薄的一层助滤剂一起刮去。细胞破碎及其碎片的分离细胞破碎的方法有机械、生物、化学等方法。大规模生产常采用高压匀浆器和球磨机，两者课题可以补充。细胞碎片的分离通常用离心分离的方法，比较困难，新方法用两水相萃取法，选择适当的条件，使细胞碎片集中在下相。6.3辅酶Q10的提取与纯化根据辅酶QI。的化学性质，选用有机溶剂萃取法，即用醇一一醚混合液萃取法进行初步纯化，主要是乙醇、石油醚。经过初步处理后，体积已大大缩小，需要进一步纯化。经过实验证明，采用高速逆流色谱法，效果较好。色谱纯度达到了99.2%，产物纯度达到了97.8%，回收率为88%。经过高度纯化后，最后采用凝胶过滤法得到纯品。就是以特定的凝胶物质为分子筛装入层析柱，再通过分离溶液时大于凝胶孔径的分子会被排阻在胶粒外，因此它们将“绕道通过”；小于该孔径的分子，由于可以自由出入胶粒内外，因此将沿着胶粒缝隙而直接流出。通过一段程度的凝胶层析柱后，大小分子将依次先后流出。7物料衡算已知发酵罐培养基的配方为：葡萄糖1.4%、麦芽糖0.7%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.8%、尿素0.04%、0.3%NaHCO、0.04%MgSO・7H20、0.2%NaCl、0.05%NHCl。344产物目标产量为501,生产菌种的单位产量为805.4mg/L,所以所需的发酵液量为：Vx805.4xlO-9x0.92x0.88=50,V二7.668x107L因为培养液中营养成分只占4.03%，所以密度接近水的密度，取p二lg/ml,所以所用发酵液的质量为：m二7.668x107x103x1二7.668xlOiog二7.7x104t液所以用水量为：m二7.7x104x95.97%二7.4x104t水培养基成分总用量为：m二7.7x104x4.03%二3x103t培由于发酵方式采用补料发酵，补料培养基用量为初始装液量的1/4，所以补料所用培养基质量为：m二7.7x104x0.25二1.925x104t补发酵罐初始装液量为：m二7.7x104x0.75/(300x4/4)二192.5t初由各组分的质量分数可算出各组分的发酵用量组分总用量/t初始用量/t葡萄糖10782.695麦芽糖5391.348酵母膏3850.963蛋白胨6161.54尿素30.80.077NaHCO32310.578MgSO•7HO4 230.80.077NaCl1540.385NHCl438.50.0968发酵罐的设计8.1发酵罐的结构通用发酵罐的主要组成部件有：1.罐体：是发酵罐的主要结构，其内壁有挡板，作用是防止液内中心产生漩涡一般用3〜5块挡板。搅拌装置：主要功能是使罐内物料混合均匀，搅拌器叶轮多采用搅拌涡轮式，搅拌轴要与罐体密封严实，防止漏液和染菌。搅拌转速为200r/min.传热装置：有夹套，列管等，这里采用外夹套。通气部分：通过空气分布器将通入的无菌空气均匀分布到发酵液中，发酵罐通风量0〜12h为1：0.67vvm,12h至发酵结束通风量为1：（1.0〜1.33）vvm。分布器有单管式和环形管式。消泡装置：用于消除产生的泡沫，最简单实用的消泡装置是耙式消泡器，直接装在搅拌轴上。进出料口：罐顶设有进料口，罐底有出料口。其他附属设备还包括试镜、人孔（手孔）、取样管等，用以观测和检修。8.2发酵罐的工艺尺寸常用的机械通风发酵罐的结构和主要几何尺寸标准化设计（见附图）其几何尺寸比例如下：H0/D=1.7〜3.5 H/D=2.5〜4 d/D=1/3〜1/2 W/D=1/12〜1/8B/D=0.8〜1.0 S/d=1〜2 h/D=1/4单位全部为m发酵罐大小用公称体积表示，V=nD2XH/4+0.15D30其中：H-发酵罐圆柱形筒身高度 D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度0d-搅拌器直径 W-挡板宽度 B-下搅拌器距罐底的距离S-搅拌器间距 h-底封头或顶封头高度已知年产量为50吨，中性淀粉酶产量为805.4mg/L,—年有300个工作日，发酵周期为72h