五味子醇提取物逆转肿瘤多药耐药的血清药理学研究

五味子醇提取物逆转肿瘤多药耐药的血清药理学研究

肿瘤化疗的最大障碍之一是肿瘤细胞对肿瘤药物产生的多药物耐药性（mdr）。MDR是指肿瘤细胞接触了某些抗癌药物后产生了对这些抗癌药物以及其他多种未接触过的、结构和作用机理完全不同的抗癌药物的耐药性。容易引起肿瘤细胞MDR的药物多为天然的相对分子质量较大的亲脂性药物,例如蒽环类:阿霉素、柔红霉素等;长春花碱类:长春新碱;鬼臼类:鬼臼乙叉苷、鬼臼噻吩苷;紫杉烷类:紫杉醇等。MDR产生的机制十分复杂,而且是多因素的。经典的耐药机制涉及到ABC(ATPBindingCassette)型膜载体蛋白家族,其中以多药耐药糖蛋白(Permeabilityglycoprotein,P-gp)最具代表性。由P-gp介导的MDR是目前研究的最为广泛和深入并在临床实践中得到证实的耐药机制。逆转肿瘤细胞的MDR从而使其恢复对化疗药物的敏感性具有非常重要的临床意义。国外对MDR逆转剂也称调节剂已进行了大量研究,包括1981年发现的以维拉帕米为代表的第一代MDR逆转剂,以PSC833为代表的第二代MDR逆转剂,及克服了第一代、第二代逆转剂毒副反应大、与其他药物合用存在药动学相互影响问题的第三代MDR调节剂,目前一些第三代逆转剂如美国礼来公司开发的LY335979正在进行临床试验。国内开展肿瘤MDR研究较晚,临床有效的逆转剂还是一项空白。五味子是常用中药,具收敛固涩,益气生津,补肾宁心之功效,药用价值很高。我们以前的研究发现五味子果仁醇提取物(FructusShisandrae,FS)及其有效单体五味子甲素(SchisandrinA)具有逆转肿瘤多药耐药的活性,能够大大提高耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本实验在前期研究的基础上,制备大鼠含药血清,利用血清药理学进一步观察含五味子果仁醇提取物血清逆转肿瘤MDR的作用及其作用机制,为开发五味子果仁醇提取物作为肿瘤MDR逆转剂应用于临床的潜能提供更扎实的基础。材料和方法1材料表面1.1特效药五味子果仁醇提取物,黑膏状,动物给药用2%Tween80助溶,蒸馏水配制。1.2动物SD大鼠,体重200～250g,购自中国医学科学院医学实验动物繁育场,饲养于GLP动物饲养室。1.3细胞、实验和培养条件人口腔上皮癌细胞株KB细胞及其长春新碱(vincristine,VCR)耐药株KBv200细胞,人肝癌细胞株Bel7402细胞由中国医学科学院药物研究所药理室肿瘤组惠赠。细胞均在含10%新生牛血清的RPMI1640培养液(含青霉素100U·mL-1,链霉素100μg·mL-1)中生长,培养条件为37℃,5%CO2,饱和湿度。用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA液消化传代。耐药的KBv200细胞在含VCR200nmol·L-1的培养液中维持其耐药性,进行实验时至少脱药培养3d。1.4药物、药物和抗RPMI1640培养基购自Gibco公司。新生小牛血清购自杭州四季青生物工程公司。注射用盐酸阿霉素(doxorubicin,DOX)购自深圳万乐药业有限公司。注射用硫酸长春新碱(VCR)购自上海华联制药有限公司。P-gp单克隆抗体JSB-1购自Zymed公司。兔抗cPKC-α(C-20)为SantaCruz公司产品。RT-PCR反应试剂盒为Promega公司产品。Trizon购自Gibcol公司。二抗均购自北京中杉生物技术有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司北京DNA合成部合成。2方法2.1药液制备药液SD大鼠雄性15只随机分为两组,正常动物组和五味子醇提取物给药组。前者每日口服给予2%Tween80液,后者每日口服五味子醇提取物400mg·kg-1,qd,共给药7次,于末次给药前12h动物禁食,末次给药后1h股动脉取血。血液室温放置1h,2000r·min-1,离心20min,取血清,同组动物血清混合,56℃,30min灭活补体,然后在超净台中用22μmol·L-1滤器过滤除菌,所得无菌血清分装,-20℃保存备用。2.2含药血清检测采用MTT法测定含药血清的细胞毒作用和肿瘤耐药逆转活性。取对数生长期的敏感和耐药肿瘤细胞接种于96孔细胞培养板内,培养24h后,加入不同浓度的含药血清及相同浓度的正常大鼠血清(均用无血清的RPMI1640培养液配制,下同),每个浓度设3～4个平行孔。继续培养72h,弃去培养液,每孔加入0.5mg·mL-1MTT液100μL,继续培养4h,弃去MTT液,每孔加DMSO150μL,混合振荡器振荡,于570nm处测定吸光度。用中效分析软件计算半数抑制浓度(IC50),耐药逆转倍数=IC50(抗肿瘤药物)/IC50(抗肿瘤药物+逆转剂)。2.3细胞蛋白提取和检测取对数生长期的KB,KBv200或Bel7402细胞,分别以相同的细胞数接种数瓶,待细胞长至对数生长期,更换含DOX10μmol·L-1的RPMI1640培养液,同时加入不同浓度含药血清,每组设3个平行对照,继续培养3h,用预冷的PBS(pH值7.4)洗3次终止反应。收集细胞,计细胞数。将离心得到的细胞沉淀重新悬浮在1.2mL盐酸(0.3mol·L-1)-乙醇(50%)溶液中,于超声波物化器上打碎细胞,10000g,离心15min,取上清液1.0mL加入2.0mL上述盐酸-乙醇溶液中,混匀。取150μmol·L-1上述混匀液于黑色96板中,用荧光酶标仪测定DOX的荧光值,激发波长为470nm,发射波长为580nm。根据DOX-荧光强度标准曲线计算106个细胞内DOX的含量。2.4培养液的制备如Lehne等所述,对数生长期的细胞接种于细胞培养瓶中,待细胞长至对数生长期,去原培养液,分别加入含不同浓度药物血清及正常大鼠血清的1640培养液,37℃,5%CO2孵箱中孵育3h。胰酶消化收集细胞,收集的细胞在100%甲醇-20℃固定10min,PBS洗涤后加入10%小牛血清/1%BSA/PBS液,室温封闭30min,然后加入1∶25稀释的单克隆抗体JSB-1,37℃孵育1.5h,PBS洗涤后,再加入1∶50稀释的FITC标记的二抗,37℃孵育1h,PBS彻底清洗细胞,流式细胞仪计数10000个细胞,测定平均荧光值。2.5rt-pcr检测gadph扩增Bel7402细胞接种于60mm培养皿中,待细胞长至对数生长期,加入不同浓度含药血清及正常动物血清。孵育3h后,用0.1%DEPC水处理的PBS洗涤细胞2次,根据Trizol试剂盒提取细胞总RNA,在紫外分光光度计测定260和280nm吸收度值,计算RNA含量。根据RT-PCR试剂盒方法进行实验。引物设计:mdr1上游引物5′-TCGTAGGAGTATCCGTGGAT-3′,下游引物5′-CATTGGCGAGCCTGGTAG-3′;GADPH上游引物5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′,下游引物:5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。第一条cDNA链合成:48℃,45min(反转录);94℃,3min(AMV灭活、RNA/cDNA/引物变性);第二条cDNA链合成及PCR扩增:94℃变性1min;58℃退火1min,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃继续延伸7min。反应完成后,取25μLPCR扩增产物加入5μL上样缓冲液(6×,0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,40%蔗糖)混匀后,进行2%琼脂糖凝胶电泳,于紫外灯下观察,凝胶扫描仪拍照。2.6指纹图谱检测以联苯双酯(DDB)为内标,五味子甲素、乙素、醇甲、醇乙、酯乙、五味子酚为对照品,应用Waters2695高效液相色谱仪,2996DAD检测器,KromasilC18不锈钢柱(250mm×4.6mm,5μm)分析含药血清指纹图谱。血清预处理方法:分别取空白血清及含药血清0.5mL,加内标物DDB1mg·mL-1贮备溶液0.1mL,加甲醇0.4mL,涡旋混合1min,10000r·min-1离心5min,取上清液直接进样。流动相:甲醇-水(70∶30);流动相流速:1.0mL·min-1;检测波长:254nm;柱温:35℃;进样量:10μL。采用内标法加校正因子测定含量。3处理数据数据用均数±标准差表示。两组间数据用t检验,以P<0.05为有显著性差异。结果1细胞毒性实验通过MTT实验观察不同浓度含药血清对KBv200,KB,Bel7402细胞的细胞毒性,结果显示,浓度小于等于10%含药血清与相同浓度的正常动物血清相比,对所用细胞无明显毒性,细胞存活率大于90%。因此我们以5%,10%作为试验剂量用于以下研究。2mtt法检测不同菌株对部位安全性的mtt实验结果KBv200细胞为人口腔上皮癌KB细胞对VCR的耐药细胞株,耐药倍数约为100倍,MTT实验结果显示,5%,10%含药血清组与含相同浓度正常动物血清组相比,能够明显逆转KBv200细胞对VCR的获得耐药性,其中10%含药血清逆转倍数为107倍,结果见表1。3等交叉耐药性KBv200细胞除对VCR有获得耐药性外,对DOX,紫杉醇等也有交叉耐药性,对DOX的耐药倍数约为10倍。MTT的结果显示(表2),5%,10%含药血清组与含相同浓度正常动物血清组相比,能够逆转KBv200细胞对DOX的交叉耐药性。4耐药性研究人肝癌Bel7402细胞与对化疗药物敏感的KB细胞相比,具有内在多药耐药性,对DOX和VCR等的细胞毒作用均不敏感,结果见表3。5%,10%含药血清组与含相同浓度的正常动物血清组相比,能够明显逆转Bel7402细胞对VCR和DOX的内在耐药性,增加细胞对药物的敏感性。5不同浓度正压剂对部位小鼠市场小鼠市场7.7%的影响如图1A所示,耐药的KBv200细胞和敏感的KB细胞与10μmol·L-1DOX孵育3h,KB细胞内DOX的浓度明显高于KBv200细胞,约为KBv200细胞的2.6倍,提示耐药的KBv200细胞有DOX外排增加或携入减少,从而使得胞内DOX含量下降。5%,10%含药血清与DOX共同孵育细胞3h,与含相同浓度正常动物血清组相比,能够显著增加KBv200细胞内DOX的蓄积量,但对KB细胞没有明显影响。用Bel7402细胞进行实验得到相同的实验结果:与含相同浓度的正常动物血清组相比,5%,10%含药血清能显著增加DOX在Bel7402细胞内的蓄积,增加幅度分别为81.5%和45.9%。6药物血清中p-gp蛋白表达水平通过流式细胞术分析P-gp蛋白的表达,结果见图2,耐药的KBv200细胞和Bel7402细胞P-gp蛋白平均荧光强度显著高于非耐药KB细胞。含5%,10%药物血清的1640培养液与KB细胞共同孵育24h,对KB细胞的P-gp蛋白表达仅有轻微降低作用,而与耐药的KBv200细胞及Bel7402细胞共同孵育24h,则能使P-gp的荧光图谱发生显著左移,荧光值明显下降,与含10%正常动物血清对照组相比,平均荧光强度分别下降17.3%,39.1%和25.9%,42.7%。提示含药血清对耐药肿瘤细胞P-gp的高表达有明显抑制作用。7mdr1基因转录水平以GADPH为对照,RT-PCR实验结果显示,含5%,10%药物血清的1640培养液与Bel7402细胞共同孵育24h,能明显降低编码P-gp蛋白的mdr1基因转录水平。结果见图3。8药物中甲素的含量在前期工作中,我们对五味子醇提取物中的已知单体化合物:五味子甲素、乙素、醇甲、醇乙、酯乙及五味子酚的肿瘤多药耐药逆转作用进行了活性筛选,发现五味子甲素(图4中用椭圆标出)有较强的耐药逆转活性。HPLC色谱分析在醇提取物和含药血清中均有甲素的存在(图4,椭圆标出),但含量较低。五味子醇提取物体外有效浓度为25mg·mL-1,采用内标法加校正因子测定其中甲素含量仅为0.75mmol·L-1,而甲素体外有效浓度为6.25mmol·L-1,推测五味子醇提取物中可能含有其他未知成分具有强的MDR逆转活性,与前期结果相符。含药血清的HPLC色谱分析结果也显示,五味子含药血清中甲素含量仅为2ng·mL-1。本研究体外实验所用浓度为10%和5%,推算甲素浓度为0.2和0.1ng·mL-1。此结果进一步提示五味子中可能含有其他未知成分发挥肿瘤多药耐药逆转作用。在HPLC图谱中,我们也发现了几个未知峰。进一步的化学分析和结果鉴定有待进行。药物应激学血清生物学活性研究和药的耐药机制中药血清药理学是指将中药或中药复方经口服给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清,用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验技术。为1988年田代真一首次命名。与传统的直接添加法相比,中药血清药理学具有多个优点,如:克服了中药或中药复方粗提物本身理化性质,如杂质、渗透压、酸碱度、pH值等对实验的直接干扰,使体外培养体系与细胞所处的内环境