植物染色体遗传与进化

植物染色体遗传与进化

染色与遗传信息从世代转移到另一代相关，并先后释放信息，控制细胞的功能和发育。1831年,英国人RobertBrown发现植物细胞核;1848年,德国人W.Hofmeister在鸭跖草的小孢子母细胞的细胞核内发现了一种可被染色的丝状体;1865年奥地利科学家GregorMendel建立了遗传学,他在植株(豌豆)杂交试验基础上总结出的2个著名遗传学定律——分离定律和独立分配定律中,并提出基因的概念;1869年,瑞士人F.Miescher从脓细胞中分离出核酸;1888年,德国人H.vonWaldeyer称这种丝状体为“染色体”(Chromosome),并猜测染色体与遗传有关。据Waldeyer的解释,染色体一词在希腊语中的意思是“带颜色的物体”。随着生物学的发展,现代技术对染色体各方面的研究发现,这仍是一个恰当的科学术语。1909年起,Morgan和他的学生以果蝇(Drosophilamelanogaster)为材料研究生物遗传规律,他们观察到一种白眼突变体与性染色体的联系,在此基础上于1910年首先提出基因定位于染色体上的论点。此后几年中,他们又发现了多个伴性基因,并以此为据总结出了遗传学上著名的基因连锁和交换规律。染色体是生物细胞中的一个重要的组成部分,每一物种都具有相对稳定的数目及形态结构,染色体能通过细胞分裂而复制,并且在世代相传的过程中具有稳定地保持形态、结构和功能的特征。染色体由DNA-蛋白质-RNA的混合物组成,在细胞周期的中期得到了最大限度的浓缩。染色体具有3个基本元素:自主复制序列(AutonomouslyreplicatingDNAsequence,ARS)、着丝粒序列(CentromereDNAsequence,CEN)、端粒序列(TelomereDNAsequence,TEL)。1983年,A.W.Murray等人首次成功构建了包括ARS、CEN、TEL和外源DNA,总长度为55kb的酵母人工染色体(YeastArtificialChromosome,YAC),分子生物学的研究进入了崭新的时代。染色体的外形、成分以及行为等在发育过程中绝不是不变的。物种在进化过程中所发生的遗传物质的变化,常表现为染色体数目和结构的变化,这种变化无疑在物种形成中起着重要作用,也表现了生物在染色体水平的多样性。1显微操作技术染色体显微分离与显微克隆是一项起始于20世纪80年代早期,并在20世纪80年代末获得突破的特异性基因克隆技术。该技术运用微细的玻璃针,在倒置显微镜下对目的基因所在的染色体区段进行切割和分离,结合PCR方法、分子克隆、DNA测序和FISH等方法,用于染色体特定区带的DNA文库构建、特异性探针的制备、疾病遗传学特征的分析和有关基因的鉴定、分析、克隆和定位等。通过对该文库的筛选,分离出染色体或染色体区段特异性的DNA位点标记(STS),DNA多态片段和相关基因,再用染色体步查技术得到目的基因。染色体显微操作技术的应用包括高密度分子标记连锁图谱、基因组物理作图以及制备染色体描绘探针以研究染色体进化研究。激光显微切割和显微克隆技术的出现使染色体显微操作技术有了新的方法。湖南医科大学在国内最先应用此技术。他们建立了人类Y染色体短臂11.2带远侧1/3至短臂末端(睾丸决定基因位于该区段内)的DNA文库。邓汗湘等对人类高分辨染色体进行了显微切割与显微克隆研究;夏家辉等运用该技术结合荧光原位杂交成功地构建了人类24个染色体区带探针池,并用8q24.1和11q23-qter探针池构建了PUC19文库2个,从8q24.1PUC19文库中,已筛出单拷贝40个,完成了31个单拷贝的序列分析,用RFLP技术,通过家系分析筛选到了与多发性外生性骨疣病紧密连锁的2个探针,利用此探针筛选λ基因组文库已获得2个分别为15kb和17kb的克隆。傅俊江等(1996)应用染色体微切割技术构建了人类第7号和第8号染色体特性探针池,并运用该探针池对一个男性染色体组进行了染色体描绘研究。徐磊等应用染色体微切割技术构建了人类高分辨染色体8q24.1区带的DNA文库,并从中筛选出48个含CA重复序列的微卫星DNA的克隆。刘江东等显微分离了刺鳅性染色体,通过有丝分裂和减数分裂研究了刺鳅的性染色体;黄琳等显微分离了鹌鹑的Z染色体,并建立了鹌鹑的Z染色体特异DNA文库,可以用来制备性染色体的描绘探针,在其它相关物种中检测Z染色体的保守同线群;戢福云等对黄鳝单条染色体进行了显微分离及特异性检测。在植物染色体研究方面,我国先后对小麦、黑麦、玉米以及王百合等进行了染色体显微分离与显微克隆研究。染色体显微操作技术自创建以来,在人类和动植物染色体结构研究、基因作图、重要基因的分离、染色体进化等方面的研究都取得了重要进展。2遗传图谱技术染色体连锁图谱,也称遗传连锁图谱或染色体作图(Chromosomemapping),是指确定界标染色体上两个遗传位点或遗传标记(已知性状的基因或特异的DNA序列)在染色体上的位置,以及彼此之间相对位置的线性排列图,是利用目标性状与基因座连锁间的关联性进行的标记。两个位点之间的距离依据它们共同遗传的概率来确定,包括单基因、双基因和多基因连锁。其构建的主要步骤包括:(1)遗传标记的选择;(2)根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合,建立作图群体;(3)群体中不同植株或品系的标记基因型的分析;(4)标记间连锁群与标记位点的确定。构建遗传连锁图谱的方法包括3点测交法、2点测交法、2点自交法以及3点自交法等。利用遗传连锁图谱可进行数量性状基因座位(QuantitativeTraitLoci,QTL)的研究、分子标记辅助育种研究以及进行目的基因的克隆等,其中应用最广的是QTL研究。QTL定位研究开始于20世纪70年代末80年代初。QTL主要是通过分析整个染色体组的DNA标记和数量性状表型值的关系,制作基因在染色体上相对位置的基因座连锁图,并估计其遗传效应。一般步骤包括:(1)构建遗传连锁图;(2)选择具有相对性状的纯系进行杂交,获得适宜的作图群体;(3)检测分离世代群体中每一个体的标记基因型和数量性状值;(4)分析标记基因型和数量性状值的相互关联,确定QTL在染色体上的相对位置,估计QTL的有关遗传参数。这两种技术结合,在育种上具有可以提高选择准确性、缩短世代间隔、增加选择差等优势,称为标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)。多态性标记与QTL在染色体上的物理连锁及它们间产生的潜在连锁非平衡,可被MAS所利用,大致分为3种类型:标记辅助回交、标记辅助指数选择以及标记辅助BLUP(最佳线性无偏预测)选择。目前,我国在棉花、水稻、小麦、桃、大豆、蕃茄等植物和猪、鱼、家蚕等动物以及人类染色体上不同的特异基因、性别相关基因和疾病相关基因等的遗传连锁图谱或QTL方面均有研究,并取得一定进展。这一技术通常被用于基因定位以及新基因发现等,尤其在分子标记技术建立后的基因定位方面有广阔的应用前景。如蕃茄的遗传图谱含有1000个分子标记,对任何基因,都可以找到与之相距在1000kb之内的分子标记。高密度基因座连锁图的绘制为我国农作物种植业、畜牧业以及渔业等领域筛选与目的基因紧密连锁的分子标记提供了良好的开端。3间接法定位探针的应用原位杂交(ISH)源于原位杂交组织(或细胞)化学(insituHybridizationHistochemistry,ISHH)。染色体原位杂交是1969年建立和发展起来的利用标记的DNA探针与染色体上的DNA杂交,直接在染色体上定位基因和DNA序列的一种技术,具有快速、安全、经济、灵敏度高、特异性强等特点。根据研究的目的不同,使用的探针也不同,基因组总DNA和基因组特异重复序列主要用来鉴定外源染色体和研究起源和演化,低拷贝和单拷贝探针主要用来构建染色体物图谱,还可用于研究免疫学、生态学和分类学等。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交3类。根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。目前已经发展了荧光原位杂交(FluorescenceinsituHybridization,FISH)、染色体原位抑制杂交(insituSuppressionHybridization,ISSH)以及多彩色荧光原位杂交(MulticolorFluorescenceinsituHybridization,M-FISH)、原位杂交显带、荧光原位杂交基因定位等技术,其中FISH技术应用最广。FISH技术是在20世纪80年代末在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传学技术。目前已广泛应用于动植物基因组结构的研究,分辨复杂的染色体易位、病毒的感染、DNA物理图谱的构建、人类的产前诊断及哺乳动物染色体进化研究领域等许多方面。如国内方面,阮庆国等研究了人类染色体8q24.1单拷贝探针;刘孟珉等研究了慢性粒细胞白血病bcr基因重排;张荣信等研究了黑麦A、B染色体着丝粒同源性;刘胜勤等研究了苯系物接触工人精子染色体数目畸变等;宋兰林等研究了特纳氏综合征患者的微小标记染色体;易宁等研究了小鼠的克隆着丝粒(SFA)DNA;欧建平等研究了不育症患者精子X、Y及18染色体等。在国外,近几年对人类疾病,尤其是遗传性疾病和癌症以及免疫、性别等相关基因的研究较为多,也有对鸡、鹌鹑、鱼、马、猴等动物以及农作物和树木等的研究报道。FISH技术与放射性同位素技术相比具有快速、安全、灵敏度高、探针可长期保存等特点。FISH技术的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记,然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。常用的探针可分3类:(1)染色体特异重复序列探针(probetochromosome-specificrepeatedsequence);(2)全染色体或染色体区域特异性探针(whole-chromosomeorchromosomeregion-specificprobes);(3)特异性位置探针(specific-locusprobe)。FISH技术的操作步骤可概括为:(1)制备染色体;(2)标记探针;(3)将探针与实验材料的靶序列进行杂交;(4)检测杂交的结果。可以应用于构建DNA物理图谱、基因组分析和转移基因整合位点的检测等方面。4流式细胞分类及染色体表现染色体涂染是一项在分子细胞遗传学水平上检测染色体上的重组、畸变、重复以及同源基因等的新技术。当用荧光染料标记探针与染色体作原位杂交时,与探针杂交的染色体上的某条染色体臂(长臂或短臂)、某一区段或整个染色体都呈现荧光。如用不同的颜色的染料标记染色体专一的探针,则不同的染色体可被涂染成不同的颜色。制备染色体涂染DNA探针可通过流式细胞分类法、克隆基因库或体细胞杂交株以及染色体显微切割和PCR扩增等途径。国际上用染色体显微切割和PCR扩增的方法制备探针进行染色体涂染具有很高的特异性和分辨力,可用来检测染色体畸变、性别鉴定、显微克隆等。该技术包括染色体DNA探针的制备和荧光标记原位杂交两个部分。用于染色体涂染的染色体DNA探针一般可以通过以下3条途径来制备:(1)流式细胞分类法(flowcytometry),该法是用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的不同,所染色的特征有其特异性,从而可以通过流式细胞分类计将特定的染色体收集起来;(2)通过特定的克隆基因文库(clonedlibraries)或者特异性的体细胞杂种细胞系(hybridcelllines)制备某条染色体整个或部分DNA探针;(3)通过染色体显微切割(chromosomemicrodissection)和PCR扩增制备特异性的染色体DNA探针。相对而言,第3种方法具有直接、准确、简便和应用范围广等优点。染色体描绘技术主要应用于人类疾病、性染色体以及染色体进化等研究,如郑文岭等研究了食管癌细胞系染色体异常;1995年以来,剑桥大学应用这项技术进行哺乳动物的染色体比对,他们运用了包YAC等的多种染色体作探针,以研究重组染色体的断裂点。1996年Science报道了一种能对24种不同标记的染色体描绘探针同时与人的染色体进行杂交的技术,发光的探针能被计算机收集、整理、分类,可用于染色体畸变、进化等研究。日本东京大学用于比较人类与灵长类猿猴的染色体;澳大利亚LaTrobe大学以染色体描绘技术探讨人的XY染色体的亲缘关系;黄浩杰等研究了人和猕猴染色体的同源性;佴文惠等研究了人和黑叶猴的染色体同源性。单祥年等显微分离小麂的Y染色体,对赤麂的染色体进行涂绘,结果表明只有Y2染色体与赤麂的性别决定相关,排除了赤麂Y1染色体在性别决定中的作用。王毅等以流式细胞仪分离小麂的Y染色体和黑麂的Y1、Y2、X+4和1号染色体,并以其为探针对黑麂的核型标本进行描绘,确认了黑麂真正的Y染色体为Y2染色体,并初步把黑麂的Sry的基因定位在Y2染色体上;武汉大学生命科学学院动物分子细胞遗传实验室易梅生等研究了人类性染色体特异DNA与3种鱼类染色体的差异;朱必才等用C-带和涂染技术研究了棕色田鼠的Y染色体等。国外实验室主要研究不同种属的动物(包括人)或植物染色体(尤其是性染色体)的比较与进化,研究过的动物有鸡、狗、狐、猴、猫、猿、鼠、兔、牛、羊、山羊以及其它鸟类、有袋类和哺乳类等。5基因定位技术的应用基因定位和基因图对遗传学、医学和人类及生物进化的研究都有十分重要的意义。它可提供遗传病和其他疾病的诊断的遗传信息,可以指导对这些疾病的致病基因的克隆和对病症病因的分析与认识,这些又取决于遗传图和物理图的相互依赖关系。通过多态位点标记进行连锁分析获得物理图的位置有助于遗传作图,同时通过连锁分析(部分有减数分裂的交换)又能指导物理作图,使基因定位更为精细。基因在染色体上定位包括荧光原位杂交技术、放射杂交体法、重叠群拼接以及染色体步移等。其应用包括:连锁分析检测基因突变指导遗传病的诊断、连锁分析进行致病基因的鉴别与定位、促进对癌基因和瘤抑制基因的定位与克隆、位置克隆与基因定位等。关于基因定位,近年又兴起一种候选基因方法(Candidategeneapproach)。此法无需经过基因图和物理图的过程,而根据某种遗传病和特定基因分别定位于染色体的同一区域,而后再发现并鉴定其基因突变,则可研究此致病基因。自1992~1993年用此法克隆基因已有十几个,如SOD1(肌萎缩性侧索硬化症)、RET(多发性内分泌促瘤2A型)基因等。现代分子生物学技术不仅使染色体的基因定位及物理图谱制作变得轻而易举,而且能详尽的知道定位于染色体DNA上的基因核苷酸顺序。据认为,人类基因组多达10万个基因,迄今已检测出的基因近5千个,仅占5%,其中1/3被定位于各个染色体上。目前大量的基因定位的研究项目已经开展起来,通常有5种不同的定位途径,包括家系中重组频率的研究、细胞杂交的方法、原位分子杂交的方法、RFLPs的应用以及微星体技术的应用等。其中RFLPs和DNA指纹在基因定位上的应用最有发展潜力。基因定位通常与基因克隆以及启动子和内含子等分析相结合,大量的研究是关于人类和动物的疾病、免疫、性别、生长和发育等相关的基因/cDNA或酶类。如Fries等利用RFLPs和原位分子杂交的方法确定了一个进化守恒的连锁群在牛第15条染色体上的位置;Georges等利用DNA指纹技术定位牛的“mh”基因;王毅等研究了黑麂Y染色体的鉴别和Sry基因的克隆及定位;张悦等应用显微切割技术获得赤麂1号、Y1、Y2染色体,将赤麂的SRY基因进行克隆、测序并将其定位在Y2染色体上,从而首次在分子水平上确定Y2在赤麂的性别决定中起真正的作用;戢福云等显微分离了黄鳝单条染色体,建立了染色体特异性探针池,作为“特定染色体DNA池”用于基因定位,为鱼类基因定位和染色体进化研究提供了一种新的可行方法;戢福云等应用PRINS(Primerinsitulabelling,引物原位杂交标记)技术定位黄鳝Sox基因;尹小燕等进行了玉米大斑病抗性基因Ht2的精细定位研究;朱卫民等进行了肺炎克雷伯菌TEM-1编码基因的克隆测序及基因定位研究;张杰等进行了地衣芽孢杆菌GXN151的纤维素酶基因cel9A的序列分析及cel48A的定位研究;郭晶心等进行了水稻抽穗期数量性状基因的定位及遗传效应分析等。6外源染色体片段转移和分子数据研究染色体的片段转移又称染色体介导的基因转移(Chromosomemediatedgenetransferring)。用显微切割方法从染色体上切割下特定的染色体片段,扩增后导入鱼体或将人工组装染色体导入鱼体并使之稳定遗传的技术。该技术的独特之处在于不需经基因重组就可转移超大型外源DNA。染色体的片段转移方法有:辐射、精子携带、置换系、易位系、杂交等,而检测技术包括:RFLP技术、减法AFLP、原位杂交等。20世纪末,国外报导从人成纤维细胞中期染色体上显微切割一段染色体片段经克隆后获得1~1.5kb的具着丝粒的染色体片段,注入小鼠胚胎并获得了首例转染色体小鼠,在其胚胎和成体细胞中含有人的着丝粒和非着丝粒DNA。不过,对染色体转移的可靠性和整合率还有待深入研究。此外,利用不完全雌核发育也可以导入外源染色体片段。Thorgaard等用射线将虹鳟鱼精子染色体部分遗传灭活后和卵子受精,可将未失活的染色体片段带人卵子,随后将卵子染色体加倍,所获得的雌核发育的卵子中含有父本的染色体片段。Luo等采用此法把鲤鱼遗传物质导人草鱼卵内,结果染色体检查证实了外源染色体片段存在于草鱼染色体分裂相内,同时实验结果也表明草鱼抗病力有所增强;SeurER等利用辐射使外源染色体片段转移给小麦。在国内,刘伟华等研究了蓝粒小麦与太谷核不育小麦间染色体片段转移;李子先研究了通过异源染色体片段易位使水稻获得特级基因途径;沈革志等用RFLP技术检测水稻染色体片段的来源;刘大钧等对导入小麦的外源染色体片段进行了鉴定并分析了外源抗性基因的稳定性;王槐等以适当参数的Nd:YAG激光微束切割大麦7H染色体后再利用微细玻璃针挑取了7HS端部片段并放入离心管中,建立了一种激光微束与玻璃针结合使用微切