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文档简介
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定实验目的1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。
实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定T-DNA插入鉴定的原理实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定突变体鉴定的步骤T-DNA插入基因的基因组序列；T-DNA插入方向的确定；T-DNA插入位置的确定；引物设计；PCR扩增；电泳检测。实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定T-DNA插入基因的基因组序列实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定点击基因编号进入网页实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定点击sequenceviewer进入实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定点击nucleotideview进入
实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定点击突变体编号后进入的网页实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定进入网站查找基因突变体及插入方向实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定基因方向T-DNA方向5’引物3’引物实验设计实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定引物设计基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥网站进行自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp以上为宜，即300+Nbp。LBa1ofpBIN-pROK2forSALKlines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定植物基因组DNA的快速提取
（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加入400ml提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上13000rpm离心5分钟；（4）离心后将上清300ml转移至一个新的1.5ml离心管中；（5）在上清中加入300ml异丙醇，混匀后于室温下13000rpm条件下，离心5分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀；（7）100mlTE溶解沉淀，将制备好的样品在4℃保存备用。（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定PCR鉴定30ml反应体系：
2ml植物基因组DNA样品
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml引物1（10mmol/L）
1ml引物2（10mmol/L）用无菌水补足体积。实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定PCR反应条件94℃3min30循环（94℃/1min，55℃/1min，72℃/1min）；
72℃延伸10min。注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整。实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定PCR安排每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下：1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5‘和3’端引物；5‘引物和LBa引物。实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定046号突变体的鉴定（1-6组）
30ml反应体系1：
2ml植物基因组DNA样品（WT）
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml0465’引物（10mmol/L）
1ml0463’引物（10mmol/L）30ml反应体系2：
2ml植物基因组DNA样品WT
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml0465’引物（10mmol/L）
1mlLBa引物（10mmol/L）
30ml反应体系3：
2ml植物基因组DNA样品（111）
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml0465’引物（10mmol/L）
1ml0463’引物（10mmol/L）30ml反应体系4：
2ml植物基因组DNA样品（111）
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml0465’引物（10mmol/L）
1mlLBa引物（10mmol/L）实验五拟南芥T-DNA插入突变纯合体的鉴定135号突变体的鉴定（7-11组）
30ml反应体系1：
2ml植物基因组DNA样品（WT）
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml1355’引物（10mmol/L）
1ml1353’引物（10mmol/L）30ml反应体系2：
2ml植物基因组DNA样品（WT）
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml1353’引物（10mmol/L）
1mlLBa引物（10mmol/L）
30ml反应体系3：
2ml植物基因组DNA样品（111）
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
1ml1355’引物（10mmol/L）
1ml1353’引物（10mmol/L）30ml反应体系4：
2ml植物基因组DNA样品（111）
3ml10×扩增缓冲液
0.5mlTaqase（5U/ml）
0.5mldNTP（10mmol/L）
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