医学免疫学教学课件：第十八讲 免疫学检测技术的基本原理

第十八讲

免疫学检测技术的基本原理

2免疫学检测方法——应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。3第一节

体外抗原抗体结合反应

的特点及影响因素一、抗原抗体反应的特点1、抗原抗体结合的特异性2、抗原抗体结合的可逆性3、适宜的抗原抗体浓度和比例4、抗原抗体反应的两个阶段4抗原抗体结合的特异性抗原抗体结合的特异性由抗原表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定。互补程度越高，特异性越强，亲和力越高。亲和力指抗体分子单一抗原结合部位与一个相应抗原表位之间互补结合的强度。用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。5抗原抗体结合的可逆性非共价键结合，易解离

范德华力静电引力氢键疏水键解离后抗原和抗体仍具有原来的特性解离度取决于

抗体亲和力的大小环境因素：如温度、pH等6适宜的抗原抗体浓度和比例免疫复合物中抗原和抗体的量肉眼可见肉眼不可见肉眼不可见7抗原抗体反应的阶段性与可见性（1）特异性结合阶段反应迅速一般不出现肉眼可见的反应（2）可见反应阶段小的Ag-Ab复合物形成较大复合物的过程易受温度、电解质和酸碱度等影响8二、抗原抗体反应的主要影响因素电解质温度37℃pH6-89三、抗原、抗体的制备㈠、抗原制备颗粒性抗原：细胞性抗原可溶性抗原㈡、抗体制备多克隆抗体单克隆抗体10四、体液免疫检测技术㈠、传统的血清学方法1.凝集反应(Agglutination)颗粒性抗原＋抗体凝集可溶性抗原＋相应抗体不凝集可溶性抗原—无关载体＋抗体凝集常用载体RBC聚苯乙烯乳胶活性碳胶体金11

凝集反应的类型①直接凝集反应：玻片法试管法微量凝集法

12凝集反应的类型②间接凝集反应：

132.沉淀反应

Precipitation可溶性抗原＋相应抗体沉淀物方法：1、单向琼脂扩散2、火箭电泳＝单向琼脂扩散＋电场3、双向琼脂扩散4、对流免疫电泳＝双向琼脂扩散＋电泳5、散射比浊（敏感、精确、自动化）6、速率散射比浊141516171819第二节免疫标记技术

Immunolabellingtechnique用酶、荧光素、同位素等物质标记抗体或抗原进行抗原抗体反应，检测抗原或抗体的技术。1、常用标记物质：酶：HRP、AP荧光素：FITC、RB200放射性同位素胶体金电子致密物质:2、用途：免疫组织化学技术：用于抗原定位（组织切片、细胞涂片、活体定位），在细胞或亚细胞水平上观察鉴定抗原、抗体、受体等。免疫定量测定：用于液体标本中抗原或抗体含量的测定。20一、免疫荧光技术㈠、荧光素：1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光）

fluoresceinisothiocyanate,FITC,495nm2、罗丹明（红色荧光）LissaminerhodamineB,RB200,3、R—藻红蛋白R-pheoerythin,R-PE㈡、荧光显微镜21㈢、常见免疫荧光技术的方法1.荧光抗体染色技术直接荧光法间接荧光法2.荧光免疫测定技术时间分辩荧光免疫测定（timeresolovedfluorescenceimmunoassay,TR-FIA）22PemphigusvulgarisIntercellularIgG

staining2324二、免疫酶标记技术

Immunoenzymatictechnique用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应，以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品中抗原或抗体的含量。1、常用酶：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AKP）2.常用方法：免疫组织化学技术酶联免疫吸附试验25㈠、酶免疫组织化学技术Normalisletof

LangerhanInsulitis-Pretype

1diabetesAlphacells

(Glucagon)Betadells

(Insulin)Autoimmunity:Diabetes26㈡酶联免疫吸附试验

EnzymeLinedImmunasorbentAssay，

ELISA原理：一种固相免疫酶技术固相载体的种类：聚苯乙烯板聚苯乙烯小珠基本方法：⑴、间接法⑵、双抗体夹心法⑶、抗原竞争法检测仪器2728三、放射免疫分析法

Radioimmunoassay,RIA同位素分析的灵敏性＋抗原抗体反应的特异性优点：灵敏度高特异性强精确性好样品用量少测定方法规范、自动化常用同位素：125I、131I、3H、14C、32P29常用抗原抗体反应的相对敏感度

反应名称敏感度（/L）血清蛋白电泳（区带电泳）1000mg免疫电泳50～100mg单向免疫扩散＜10～20mg双向免疫扩散＜10mg火箭电泳＜5.0mg对流免疫电泳＜1.0mg免疫比浊1.0mg补体结合反应10ug凝集反应10ugELISA＜10ugRIA＜10ug30第三节

免疫细胞及其功能检测一、免疫细胞的分离选择性分离细胞的依据：细胞大小、密度、表面电荷、粘附能力、细胞吞噬能力、细胞膜上的特异性标志等；31㈡、外周血中单个核细胞分离单个核细胞＝淋巴细胞＋单核细胞细胞分离液：Ficoll-hypaque密度梯度离心法Percoll不连续密度梯度法32㈢、T、B淋巴细胞分离1、免疫磁性微珠分离法（Immunomagneticbeads,IMB)用包被用抗体或抗原的可磁化颗粒（Fe3O4+大分子材料）作为免疫反应的载体，快速高效的分离，无需离心沉淀分离技术；33㈢、T、B淋巴细胞分离5、荧光激活细胞分离仪分离法

流式细胞术（Flowcytometry,FCM）将光学流体力学、电子学和计算机等多种技术综合为一体，对单个细胞进行快速、灵敏、多参数的定量测定，并进行综合分析的一项技术。荧光激活细胞分离器（Fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）34荧光激活细胞分离器组成部分：气控单细胞层流系统激光光源系统光检测及信息处理系统细胞分离纯化系统35流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能36㈢、淋巴细胞体外增殖试验1、淋巴细胞转化试验形态学方法：淋巴母细胞计数

3H—胸腺嘧啶核苷掺入法MTT检测法：

线粒体脱氢酶

四甲基偶氮唑蓝蓝黑色甲潜∝活细胞（MTT）（formazan）

570nm测吸光值37㈣、细胞毒性试验1、抗体依赖性细胞介导的细胞毒