医学免疫学教学课件：免疫学检测技术

ImmunologicalTechniques免疫学检测技术一系列特异性定量或定性检测抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等的实验方法，广泛应用于临床医学的辅助诊断和生物学领域的研究。第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素抗原抗体反应的特点

抗原抗体反应的影响因素抗原抗体反应的特点Specificity特异性Reversible可逆性Ratioandvisibility成比例性与可见性twosteps阶段性二者的结合主要依靠静电引力、氢键、范德华力等，需要合适的温度、pH、离子强度以及完整的抗体，这种结合是可逆的。抗原抗体反应的影响因素:Electrolyte(电解质）Temperature（温度）Phvalue（Ph值）第二节检测抗原和抗体的体外试验

Agglutination凝集反应Precipitation沉淀反应Immunolabelingtechnique免疫标记技术

Proteinmicroarray蛋白质芯片技术Agglutination(凝集反应）颗粒性抗原与相应抗体相遇，在适量电解质存在情况下，出现肉眼可见的凝集块。用于检测:Bloodtype血型Bacteria细菌直接凝集反应

间接凝集反应间接凝集抑制试验检测细菌检测红细胞Co-agglutination协同凝集试验Coomb’stestPrecipitation（沉淀反应）可溶性抗原与相应抗体反应后，在体外介质中出现肉眼可见的沉淀物。可定性和定量检测相应抗原Simpleagardiffusion(单向琼脂扩散）Rocketelectrophoresis（火箭电泳）Doubleagardiffusion（双向琼脂扩散）Counterimmunoelectrophoresis（对流免疫电泳）Immunolabellingtechniques(免疫标记技术）

酶标记技术荧光标记技术

同位素标记技术胶体金标记技术化学发光标记技术ELISA(酶联免疫吸附实验）Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA将抗原抗体反应的高度特异性与酶对底物的高效催化作用结合，通过酶分解底物产生有色物质，用酶标仪测定光密度值，以反映抗原或抗体的含量。辣根过氧化物酶（HRP)碱性磷酸酶（AP)双抗夹心法WesternBlot(免疫印迹）Immunohistochemicaltechnique免疫组织化学技术Immunofluorescence免疫荧光法定性检测:荧光显微镜定量检测:流式细胞仪检测细胞表面或内部的抗原流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。流式细胞术原理外周血淋巴细胞放射核素标记标记抗原与被测物（或标准品）对有限量的特异抗体发生可逆性的竞争结合反应，放射性标记复合物形成量与被测物的含量呈负相关函数关系放射免疫测定:(RIA)YYYYY+Y?主要优点：

生物制剂，稳定性受多种因素影响，需有质量控制措施（QualityControl)

灵敏度：可达10-9―10-12g

特异性强：抗原抗体结合具有很高的特异性

应用范围广：凡能制备相应抗体的生物活性物质，只要含量不低于RIA探测极限，都可建立

操作简便：所需试剂少，测量及数据处理易于实现自动化主要缺点：

灵敏度很难超过10-15g水平Chemiluminescenceimmunoassay化学发光免疫分析Immunologicalcolloidalgoldsignature免疫胶体金标记技术早早孕试纸条几种常见的免疫标记技术的比较项目荧光免疫技术酶免疫技术放射免疫技术金免疫技术化学发光免疫技术标记物荧光素酶同位素胶体金化学发光物质敏感性中等-高高(10pg)高<1pg高(50pg)高<1pg特异性高高高高高检测对象抗原/抗体抗原/抗体抗原抗原/抗体抗原/抗体所需仪器荧光显微镜肉眼/分光光度计R计数仪/液闪仪肉眼/电镜…光度计/光照度计能够同时分析上千种蛋白质的变化情况，使得在全基因组水平研究蛋白质的功能(如酶活性、抗体的特异性、配体-受体交互作用以及蛋白质与蛋白质或核酸或小分子的结合)成为可能。蛋白质芯片免疫细胞的分离及分析Separationandpurification分离与纯化Functionanalysis功能分析TcellBcellMacrophageIsolationofPBMC将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。粘附贴壁法免疫细胞亚群的分离IsolationTorBlymphocytesE-flowerMACSFACS可溶性MHC四聚体技术E花环沉降法

本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。E花环MACSMidiMACSQuadroMACSMACS分选柱MACS技术分选的CD8阳性T细胞（箭头所示为磁性结合在细胞表面的微珠）FACS1.2%96.3%可溶性MHC四聚体技术T细胞功能检测Proliferation增殖Cytotoxicity细胞毒活性Cytokinesecretion细胞因子分泌体外Invitro增殖功能检测3H-TdR掺入法MTT法CFSE法SkinTestInvivoCelldivisiontrackingusingCFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯

)CFSEStructureOOO-C-CH3CH3-C-OOOOON-O-COODilutionofCFSEwithcelldivisionLyonsandParish,1994JIM,171;131Divisions:3210CFSEFL-1(Log)Divisions:

3210细胞毒活性检测Cr51释放法LDH法细胞染色法凋亡检测法：琼脂糖电泳，tunel,FACSAlsobeusedtoestimateNKfunction检测细胞凋亡的方法形态学检查法：电镜，凋亡小体琼脂糖凝胶电泳法：梯状DNA图谱流式细胞仪检测法：亚二倍体峰，ANNEXINV/PITUNEL法：可原位检测细胞因子检测ELISAELISPOT生物学活性检查法PCRELISPOT(酶联免疫斑点法）Enzyme-linkedimmunospotassay用已知细胞因子的抗体包被固相载体，加入待检的效应细胞，温育一定时间后洗去细胞，如待检效应细胞产生相应细胞因子，则与已包被的抗体结合，再加入酶标的抗该细胞因子抗体，加底物显色。用于单一效应细胞分泌的某一种细胞因子的测定。B细胞功能检测增殖抗体分泌能力:hemolyticplaqueassay溶血空板实验，ELISPOT细胞因子分泌吞噬细胞功能检测趋化功能：Transwell培养板吞噬功能:NBT，颗粒性荧光染料Transwell培养板KeyWordsSerologicalreactionagglutinationprecipitationELISAELISP