大鼠骨质疏松模型的建立

大鼠骨质疏松模型的建立

随着老年人口的增加，骨质疏松症已成为老年人面临的主要疾病之一，骨质疏松症的治疗和预防研究日益受到重视。如何选择合适的骨骼松弛动物模型是方法学和实验条件的基础。目前，最基本、最经济的治疗骨质疏松症的方法仍然是钙营养疗法，通过营养控制建立更接近自然状态的大鼠骨骼松弛模型。作者试图在饲料中结合不同比例的钙和蛋白质，以建立适合大鼠骨骼松弛的动物模型。1材料和方法1.1动物21日龄雌性清洁级Wistar大鼠,体重38～40g,复旦大学实验动物部提供(合格证号02-22-4)。1.2i-bgp试验酪蛋白上海乳品二厂生产;碳酸钙上海泗联化工厂生产;99mTC-MDP上海医科大学红旗制药厂生产;125I-BGP试剂盒,解放军总医院长城免疫技术研究所生产,灵敏度<0.22μg/L;125I-E2试剂盒,天津DPC生物技术和医学产品有限公司生产,灵敏度5ng/L。1.3材料、仪器和仪器SPA型单光子大鼠骨密度仪,中国测试技术研究院装置,放射源为125I,精密度为2%;DPX-L型双能X线骨密度仪,美国LUNAR公司生产,能谱38/Takev,高压稳定±0.05%,仪器精密度1%。附动物全身骨密度测定软件;Elscientsp-6型SPECT,附针孔准直器及低能高分辨率准直器;PE-3110型原子吸收分光光度计;岛津万能材料测试仪,AG-20N型;HITACH-7110型全自动生化仪。1.4饲养及蛋白质40只大鼠按体重随机分成5组,第一组为对照组,2～5组为实验组,组间体重差别小于1g,不锈钢笼单笼饲养,自由饮水,饲喂不同蛋白质,钙含量水平的全价合成饲料见表1。参照AOAC建议方法进行饲料配方。1.5生长试验实验第1周至第7周每周称量体重2次。实验第8至20周每周称重1次,记录体重增长。1.6巴比妥钠的应用大鼠称重,以50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠,动物麻醉后置于DPX-L密度仪探头下,应用动物全身骨密度测定软件作全身扫描,图象显示在荧光屏上,并自动打印测定结果。1.7戊巴比妥钠tc-mdp实验结束前一周,以玻璃固定器固定大鼠,暴露鼠尾,在离鼠尾根3cm处用酒精棉球擦拭数遍,并用手术反光灯(60W)照射尾部。使其尾静脉充盈,用1ml针筒准确吸取30MBq的99mTc-MDP静脉注入。3h后,以50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠。动物麻醉后,俯卧固定在解剖台上,放在配有低能高分辨准直器的SPECT探头下,采集矩阵128×128,采集计数150K数据经计算机自动处理,骨扫描图像显示于荧光屏。1.8血清p、me大鼠麻醉后取股动脉血,使用甲基麝香酚兰测血清Ca,直接测定法测定血清P、血清Mg,对硝基苯磷酸二钠速率法测定血清AKP含量。125I-BGP试剂盒测血清BGP含量,125I-E2试剂盒测血清E2含量。1.9测定的液体生化值实验结束前,用代谢笼收集大鼠24h尿液。使用EDTA直接滴定法测尿钙,茚三酮法测尿羟脯氨酸。1.10数据分析和方法动物处死后,取右侧股骨去尽肌肉及韧带组织,称湿重。用千分卡测量股骨长。然后在2份三氯甲烷和1份甲醇混合液中脱脂72h后,置120℃烘箱烤1h,股骨称重即为去脂干重。再根据阿基米德定律测股骨体积。把股骨置坩埚炭化后放入Muffer炉中800℃灰化6h,测得股骨的矿物质含量。最后用原子吸收分光光度计测骨钙。左侧股骨去除附着的肌肉和结缔组织,安置在装有蒸馏水的有机玻璃盒支架上,以全长的二分之一交界处为测量点,应用SPA单光子骨密度仪作骨横越扫描,测出值即为股骨骨密度。然后用AG-20N岛津万能材料测试仪(跨越10mm,速度为5mm/min),分别测定并记录最大承受值和骨折时的强度,骨折时的力学强度即为股骨抗弯力强度。1.11骨组织病理学检测处死动物后,取右侧胫骨和第三腰椎,去除附着的肌肉和结缔组织,用10%福尔马林固定,常规脱钙,石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察骨组织病理学改变。1.12数据处理和分析全部数据均经过统计学处理,采用方差分析和t检验方法进行显著性检验。2结果2.1周起至第20周实验情况低蛋白低钙和低蛋白中等钙两组分别和对照组比,从实验第2周起至第20周实验结束,体重差异极显著(P<0.001)。高蛋白低钙组与对照组相比仅在实验结束的第20周,即终体重偏小,动物生长发育状况优于低蛋白低钙(表2)。2.2密度差异的分析高蛋白低钙和低蛋白低钙组动物全身骨密度和股骨骨密度分别与对照组相比,差异极显著(P<0.001)。低蛋白中等钙组动物全身骨密度与对照组相比,差异有显著性(P<0.05)(表3)。2.3总体压的比较见表1高蛋白低钙和低蛋白低钙组动物股骨湿重、长度、体积均小于对照组,差异有显著性(P<0.05)。高蛋白普通钙组动物股骨湿重高于对照组,差异极显著(P<0.001)(表4)。2.4低蛋白普通钙对大鼠骨钙量的影响高蛋白低钙和低蛋白低钙组动物的抗弯力强度、去脂干重、灰重、骨钙含量分别与对照组相比,差异极其显著(P<0.001)。低蛋白普通钙组动物的抗弯力强度、去脂干重、骨钙含量与对照组相比,差异均有显著性(P<0.01)。高蛋白普通钙组动物的去脂干重、灰重、骨钙含量均高于对照组,差异有显著性(P<0.05)(表5)。2.5血清钙、白低钙、血清磷、各指标血清钙和血清镁均以对照组为最高,低钙组包括高蛋白低钙和低蛋白低钙为最低。血清磷以高蛋白普通钙组为最高,高蛋白低钙组为最低。血清AKP以高蛋白普通钙组为最低,低蛋白组包括低蛋白低钙和低蛋白普通钙组为最高,但以上比较均无显著性(表6)。2.6钙、尿中氨基酸含量详见表7。2.7对比两组患者的血清p>0.0.0高(低)蛋白、低钙两组动物的BGP含量明显低于对照组,差异极显著(P<0.01)。高(低)蛋白、低钙两组动物的E2水平也较低,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)(表8)。2.8斯皮尔曼的结果低蛋白低钙组的放射计数明显高于其余各组,而高蛋白中等钙组的计数最少。高蛋白低钙动物的计数也较少(表9)。2.9骨小梁表面类生根低蛋白低钙和高蛋白低钙组大鼠骨小梁细小,疏松排列,骨髓腔相对变宽,骨小梁表面类骨质增生不明显(第195页图1、2)。对照组动物骨小梁明显粗大,排列紧密,骨髓腔相对变窄。骨小梁表面类骨质增生明显(第195页图3)。3蛋白质稳定的检测骨质疏松是以骨量减少,骨组织显微结构改变和骨折危险频度增加的疾病。形成骨质疏松可有以下四种表现。骨矿物质和骨基质等比例的减少;由于骨矿物质的减少,所以骨骼正常荷载功能发生变化,在不致发生骨折的外力作用下也可发生骨折;在X线照片上,光镜病理片和电镜下及骨形态计量学方法都可以发现骨组织的结构和量发生变化;用各种骨密度测量法、生物化学检测法都可为诊断骨质疏松症和鉴别诊断提供重要的参数。当机体处于钙边缘缺乏状态时,即当我们给予低钙(0.025%)膳食时,尿钙和粪钙减少有利于钙存留,可抑制骨钙动员,但机体对低钙摄入的适应能力有一定限度,当长期饲育极低钙膳食时,机体也就不得不排除该排出钙,即为钙的强制性排出,钙来源于骨骼,所以骨质疏松大鼠组的骨钙含量低。高蛋白摄入使肾小球钙滤过率上升尿钙排出增加。同时高蛋白摄入也使蛋白质代谢产物固定酸的含量上升,肾近曲小管钙重吸收能力下降,也可引起尿钙升高。高蛋白摄入激发了胰岛素与胰岛素样生长因子(2GF-1)的调节作用。研究表明,膳食蛋白质加倍,尿钙增加50%,动物蛋白质(如酪蛋白)的高钙尿效应大于植物蛋白质(如大豆蛋白)、含硫氨基酸的高钙尿效应大于非含硫氨基酸。人群中蛋白质摄入量与股骨上端骨折发病率显著相关。本实验中低蛋白低钙组大鼠虽然骨质疏松指标与对照组差异极显著,但这组动物生长极缓慢,成年体重极低,饲料效价低,可能有不可控制的因素导入模型。而高蛋白低钙组动物生长良好,外观和对照组大鼠一致,其股骨骨密度,股骨体积,股骨湿重,股骨去脂干重,股骨灰重,股骨抗弯力强度分别与对照组相比,差异均极显著(P<0.01)。符合骨质疏松的特征即骨量(骨灰重、骨钙含量、骨密度)的明显减少。股骨的湿重,去脂干重、灰重、骨钙含量数据之间具有高度相关性,说明本试验对股骨的处理得当。值得一提的是,在本试验采用的骨质元素样品制备条件(去脂股骨在坩埚电炉上炭化后放入Muffer炉中800℃灰化6h)下,不能用PE-3110型原子吸收分光光度计测出Mn、Mg、Cu、Zn、Fe等微量元素。这可能与灰化温度过高有关。高温致使的样品挥发对含量在30%以上的钙影响不大,但对其他微量元素却有着较大影响,有文献报道,温度应控制在450℃,24h灰化。高蛋白低钙组骨质疏松模型动物血清钙、血清磷、血清镁和血清碱性磷酸酶含量,其变化虽有规律但与对照组比较差异均无显著性,这可能与机体会通过一系列适应性反应来维持骨量有关,如低钙摄入使血PTH升高,然后肾细胞中磷含量增高,肾1α-羟化酶活性上升,肾近曲小管1,25(OH)2D3合成加快,小肠上段钙主动吸收加快,粪钙减少,最终使血钙又回升。本次研究结果提示:骨质疏松模型动物BGP水平明显低于对照组,说明高蛋白低钙组大鼠骨转换或骨形成能力低下。尤其值得注意的是,当BGP低于正常时,其血清钙、磷、镁和AKP值与对照组无差异(P>0.05)。由此可见,血清BGP与BMD一样对骨形成和骨转换变化的反映较血钙,血磷、血镁,血AKP反映更为敏感可靠。雌二醇对骨的主要作用是抑制骨吸收。本实验中骨质疏松模型动物的E2值偏低,使骨吸收加快。高蛋白低钙骨质疏松模型动物尿钙,尿羟脯氨酸的含量均高于对照组(P<0.001)。高蛋白和极低钙膳食均促使大鼠钙的强制性排出。当大鼠处于骨转换的负平衡时,还可引起骨的胶原蛋白代谢异常,促进尿HOP的排泄增加,从而导致骨韧性降低,脆性增加。结果提示:尿钙及尿羟脯氨酸的测定须收集24小时尿,能够比较准确反应机体钙HOP的排出水平。可应用空腹晨尿测尿Ca和尿肌肝比值(Ca/Cr)。虽然报道人体采用此法,灵敏准确,不受尿量硬响。但对于大鼠却存在尿量少,无法排除夜间尿和晨浓缩尿。所以,大鼠尿样的采集正确与否,直接影响着尿液生化结果的准确性。高蛋白低钙骨质疏松模型大鼠全身骨密度测定和SPECT全身骨显像,均在动物活体进行,和人体的防病、治病,药物疗效等方面应用,有良好的对比性。SPECT的图像观察比较直观,并在活体上反映了骨代谢状况。高蛋白低钙骨质疏松模型大鼠骨组织病理发现大鼠骨小梁细小,疏松排列,骨髓腔相对变宽,骨小梁表面类骨质增生不明显。有文献报道幼鼠缺钙所致病变可是骨质疏松症,或是佝偻病。青春期钙摄入不足对峰状骨质会产生不可逆的有害影响。在幼鼠,影响骨量的最主要的