荧光原位杂交技术的研究进展

荧光原位杂交技术的研究进展

原子能分子杂交技术是目前最广泛应用的分子之一。我们可以识别原子间的异质性。该技术是分子克隆技术的重要组成部分。原位杂交技术（insituhybridization）是在核酸分子杂交基础上发展起来的一门技术,染色体荧光原位杂交技术的原位杂交不是在溶液中或在滤纸上进行，而是在制作的载玻片上进行的。染色体荧光原位杂交技术（FISH）是利用标记好的DNA或RNA与细胞染色体核苷酸进行杂交，检测后者在细胞内的存在及其数量和结构改变的方法。单基因特殊染色体区域，整条染色体或种特异基因组均可特异标记而显示出来。过去探针均采用放射性物质——同位素来进行标记，其灵敏度虽然较高，但有几个主要缺点：实验周期长；背影深；分析复杂；放射性探针不稳定；污染环境，对人体健康不利等。荧光（非放射性）原位杂交正是弥补了以上的缺点。与放射性标记相比，非放射性标记具有以下优点：(1)用荧光试剂标记探针经济、安全，同时在特异性、速度、探针稳定性方面具有明显的优势。(2)多色FISH可以在同一核中显示不同颜色，从而可检测多种序列。(3)应用不同的探针可以显示某一物种全部基因、某一染色体或染色体片段。(4)能通过几次免疫化学反应，杂交信号增强显著，从而提高灵敏度。(5)杂交信号定位更加准确，分辨率可达3～20Mb。目前，FISH经过不断完善，已经形成一系列的新技术，如原位杂交显带（insituhybridizationbanding,ISHB）、基因组原位杂交（gnomicinsituhybridization,GISH）、染色体涂色（chromosomepainting）、多元荧光染色体原位杂交等。1双链dna分子从DNA的结构可以得知，DNA为双链双螺旋分子，其中一条链与另一条链的核苷酸序列互补。因此，两条来源不同的具有核苷酸互补关系的单链DNA（或一条DNA和一条RNA）在去掉变性条件后互补的区段能够逐步形成双链DNA（或DNA和RNA杂交）分子。一个探针本身是一个具有特定序列的DNA或RNA片段，它能作为DNA分子中某一序列的补充物。靶DNA序列中有其互补序列会在适当的条件下进行结合（杂交）。荧光原位杂交就是利用这一原理将标记探针同组织细胞或染色体DAN进行分子杂交，经荧光检测体系对待测核酸进行各种分析。1.1染色体检测试剂常用的探针是染色体特异性的重复DNA序列，这些序列定位于染色体的着丝粒或端粒，主要用于快速检测染色体单体和三倍体。还有一种常规探针是从基因组DNA文库中分离出来的全长染色体探针，用于染色体的异位或畸变。1.3探针类型的影响杂交前首先双链探针DNA和染色体DNA进行变性，变性温度和时间随着探针类型而变化。杂交在染色体制片上进行，杂交液浓度、pH值、杂交温度等随着探针DNA和染色体DNA最适退火条件而变化。1.4探针用直接标记和间接免疫荧光法检测检测方法也有直接和间接之分，如果探针用直接方法标记的可直接在荧光显微镜下观察，如果探针用间接方法标记的必须通过间接免疫荧光法进行检测。2染色fish的应用2.1细胞遗传鉴定人类有许多遗传病和恶性肿瘤是染色体结构和数目畸变引起的，因而无法用常规的细胞遗传学方法进行鉴定。而FISH的建立，不仅能为易位性重排，而且能为重复、缺失或插入性重排确定其重排类型、来源和断裂点提供可靠的证据，因而在基因诊断和肿瘤分析方面具有重要意义。2.1.1fish的组织学检测用染色体涂色或着丝粒特异性探针很容易确定人类染色体数目的异常，如X、Y、21、18、13号染色体的异常。在肿瘤细胞遗传学研究中，异倍体和多倍体实属常见，而中期分裂相又难获得，FISH更能显示它的不凡之处。在染色体结构异常的诊断研究中，也能提供最可靠的依据，FISH也是鉴别一些环状染色体或在额外小染色体研究中提供最可信的方法。2.1.2fish的应用某些遗传疾病，如:Duchenne/Becker肌营养不良、Miller-Dieker综合症和DiGeorge综合症等，大多数都是因为染色体微小缺失而引起的，这些病用高分辨染色体或RFLP分析方法都很难观察到，而用FISH就很容易观察到。同样FISH可用于基因重复性遗传病，如CharcotMarie-Tooth病，在17号染色体上出现PMP-22基因双重杂交信号。应用Y-特异性DNA探针，包括新近分离的SRY基因，能够通过FISH方法诊断和研究性分化异常或性反转，如XX男性的出现。分离到的DNA序列，特别是重组的Cosmid和YAC克隆，能直接通过FISH来定位，而采用多种颜色同时标记并结合中期染色体和间期染色体方面的信息，能快速确定一系列DNA顺序之间的相互次序和距离。2.3外源染色性状的控制野生植物常有一些比较好的性状，如抗病性、抗旱性、耐碱、耐酸等，为很多植物所缺少，而这些性状由一些抗性基因所控制。在育种上，通常将野生种和栽培种进行杂交，以获得既有良好性状，又有经济价值的杂种后代。因此，常常要用GISH的方法对杂种后代进行鉴定，通过检测信号来判断是否有外源染色质渗入。现已有了用GISH方法对小麦杂种进行研究的例子。2.4．基因整合度检查FISH是检测转移结果和所转基因是否表达的最直观简便的方法。它检查所转基因是否存在于受体细胞核内，是否整合于染色体及其位置等。此外，如果使用适当的DNA链为模板制备探针，那么利用这种特征可以在细胞中检查目的RNA的存在，并推测相应基因的转录情况。3原位延伸法fps随着标记手段、检测试剂以及荧光观察等技术的发展，染色体FISH的应用范围已不断拓宽。激光共聚焦显微技术的发展，使得核的三维重建可以在计算机的辅助下得以实现。FISH不仅可用来定位基因，而且可用于研究基因在间核中的位置。初步的结果显示，染色体上基因的拓朴结构，有可能影响基因的生物学功能。FISH的进一步发展，还将开发出稳定有效的方法，以定位更短的基因片段（50～1000bp），使研究者们可以方便地定位来自cDNA的基因，从而加快物理图谱与基因图谱的绘制。一般认为，原位延伸FISH技术，可能是有希望的候选方法。首先使短片段探针与染色体发生结合，然后在聚合酶dNTP标记物以及其它条件下，使探针延伸，渗入标记物，再进行荧光检测，因此，该方法又被称为引物介导的原位标记（PRINS)。PRINS的建立将沟通细胞遗传学与分子遗传学之间的鸿沟，为从染色体水平原位研究基因转录、重排、扩增、基因组结构与调控等诸多分子生物学课题开辟新的途径。1.2探针标记：探针标记有直接和间接2种标记法。直接标记法是将荧光物直接标记核苷酸上。间接标记方