土壤污染生态研究中的组学技术

土壤污染生态研究中的组学技术

随着工业化、城市化和农业一体化的快速发展，人类对农业资源的高度开发和利用导致了环境的日益严重的显性和隐性污染，已成为世界和社会的中心。人们对污染问题的普遍重视也极大地促进了污染生态学的发展。随着分子生物学、系统生物学以及各种高新检测技术的发展,许多新兴的分子生物学和“组学”研究方法与技术逐渐被引入到污染生态学的研究中。这些技术的引入揭示了许多污染生态学中的重要机理,同时也为环境监测、污染治理与生物修复等领域提供了更为科学和灵敏的方法,从而极大地推进了污染生态学的理论和实践的发展。应用于污染土壤微生物生态的分子生物学技术大致可分为两类:一类是核酸杂交技术,包括原位杂交技术(Insituhybridization,ISH)及由其发展而来的荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization,FISH);另一类是基于PCR的DNA指纹图谱分析技术,包括扩增核糖体DNA限制性分析(AmplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)、末端限制性片段长度多态性(Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)、变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)以及单链构象多态性分析(Singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)等。这些技术在污染土壤微生物多样性的研究中已经得到了较为广泛的应用。进入21世纪以来,随着新一代高通量测序技术的发展,宏基因组学研究极大地扩展了对土壤微生物群落的基因组成、意义以及遗传变异性等方面的知识。然而,如何将污染土壤中微生物的多样性与其功能联系起来,仍然是污染生态学研究中一个倍受关注的科学热点问题。随着蛋白质组学技术和生物信息技术的发展,宏蛋白质组学和代谢组学的出现扩展了对土壤微生物遗传和功能多样性的认知范围。这一系列“组学”(-Omics)的研究,逐步把分子生物学时代推向系统生物学时代。本文分别综述了分子生物学和系统生物学中主要技术的原理、优缺点及其在土壤污染微生物生态学研究中的应用进展。1土壤微生物多样性的分析方法土壤中存在的大量微生物对整个生态系统产生着重要的影响,土壤微生物多样性是调节陆地生态系统功能的至关重要因素。然而,随着工业化、城市化、农业集约化的快速发展,大面积土壤环境受到严重污染,在污染的胁迫下可能导致土壤微生物群落多样性和结构的变化。研究土壤微生物多样性的方法很多,目前大致可分为以下几类:(1)传统的微生物平板分离培养方法;(2)基于微生物碳源利用的Biolog微平板分析法;(3)磷脂脂肪酸分析法;(4)分子生物学分析方法;(5)其他方法,如用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸法、用于测定土壤酶活性的分析方法等(图1)。其中,基于核酸分析的分子生物学方法克服了传统的微生物分离培养技术的局限,可以从分子水平揭示土壤微生物生物多样性和群落结构,因此正日益成为学术界的研究热点之一。本节主要综述了核酸杂交技术和基于PCR的DNA指纹图谱分析技术等分子生物学方法的原理、优缺点及其在污染土壤微生物生态学研究中的应用现状与发展前景。1.1原子能混合分析技术1.1.1土壤环境微生物多样性1988年,Giovannoni等首次将原位杂交技术引入细菌学的研究,使用放射性标记rRNA寡核苷酸探针,特异性探针进入待测样品细胞内与DNA或RNA杂交,以确定探针的互补序列在细胞内的定位,进而分析目标微生物在样品中的构成与分布情况。由于该技术的高度特异性和灵敏性,近年来被广泛应用于土壤环境微生物多样性的研究。用于土壤微生物多样性研究的常用探针包括:rRNA基因探针、抗性基因探针、代谢酶基因探针等。其中,具有种属特异性的16SrRNA或23SrRNA基因探针是核酸杂交技术中最常用的探针。目前已针对不同种属的微生物设计出多种特异性rRNA基因探针,包括细菌EUB338探针、古细菌ARCH915探针、α变形菌ALF1b探针、β变形菌BET42a探针等。应用抗性探针对污染土壤特别是重金属污染土壤样品进行杂交也是检测污染土壤微生物群落的有效方法之一,目前研究和应用较为广泛的抗性探针包括抗Hg基因merA探针、抗铜基因cop探针、抗Cr基因chr探针等。此外,还有文献报道针对编码特异污染物降解酶基因的探针,如分别利用编码石油、四氯乙烯以及三氯乙烯降解酶的基因探针研究土壤中污染物降解菌的组成与分布。1.1.2微生物检测技术1989年,DeLong等首次在核酸杂交技术中引入荧光标记的寡核苷酸探针,将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合形成了新技术——荧光原位杂交(FISH)技术。由于与放射性探针相比,荧光探针更安全、方便、实用,从而在环境微生物监测中得到了广泛应用。该技术主要包括以下几个步骤:(1)样品固定;(2)样品的预处理;(3)预杂交;(4)探针和样品变性;(5)杂交;(6)漂洗去除未结合的探针;(7)检测杂交信号。通过在环境样品上直接原位杂交,不仅可测定不可培养微生物的形态特征及丰度,而且可原位分析它们的空间及数量分布。Yang和Zeyer采用FISH方法检测了四氯乙烯(PCE)污染地区降解菌Dehalococcoides的丰度。Matturro等采用酶联荧光原位杂交(Catalyzedreporterdeposition-FISH,CARD-FISH)联合实时定量PCR技术,对含氯溶剂污染场地中有机氯降解菌的分布与活性作了定性与定量研究,证实了该污染场地中脱氯菌群及其还原脱氯活性的存在。FISH技术在环境微生物学应用中也存在一些局限性,如荧光信号弱、清晰度不够高等。要解决这些问题,必须将FISH技术与其他分析技术相结合,如酶联荧光原位杂交(CARD-FISH)和酪胺信号放大(Tyramidesignalamplification,TSA)技术等。相信随着分子生物学技术和其他科学仪器设备研制技术的不断发展,FISH技术将为污染生态学研究提供更为广阔的应用前景。1.2基于pcr的dna索引分析技术1.2.1arra方法ARDRA是基于PCR技术,对rRNA基因片段选择性扩增产物进行分析的一种简便有效的方法。其主要原理是对微生物rRNA的PCR扩增产物用限制酶进行切割,然后再对酶切产物进行电泳鉴定并进行限制性片段长度多态性分析。由于此方法不受菌株是否纯培养的限制,不受宿主的干扰,具有特异性强、效率高的特点,因此被广泛用于研究微生物的生物多样性。ARDRA方法的缺点在于工作量较大,对于大量样品的分析,此方法显得费时费力。Smit等采用ARDRA方法研究了Cu污染对土壤微生物群落多样性的影响,结果表明Cu污染土壤中的微生物多样性明显减少,并且微生物群落结构发生很大变化,但是Cu污染对氨氧化菌的多样性没有影响。夏月等对不同Cd和Pb污染水平的土壤微生物进行了群落水平上的ARDRA分析,结果表明,5mgkg-1Cd和500mgkg-1Pb污染对土壤微生物群落组成有一定影响,但低于该浓度值的重金属对土壤微生物群落的多样性却没有显著性影响。1.2.2t-rflp技术T-RLFP是对现有的ARDRA技术的延伸,其操作过程同ARDRA技术基本相同,所不同的是在PCR扩增16SrRNA基因的过程中,其中一个引物用荧光标记,PCR产物经限制性内切酶进行消化后以DNA测序仪分离,通过激光扫描得到荧光标记端片段的图谱,图谱中条带(或波峰)的多少表明了群落的复杂程度,峰面积的大小代表了该片段的浓度,即相应群落的相对数量。与其他指纹图谱技术相比,T-RLFP技术具有分析高通量、快速灵敏、重复性好且结果数据化等特点,对分析复杂群落的结构较其他指纹技术更具有明显优势。但是,T-RFLP技术所产生的末端限制性片段(TRFs)在数据库中的匹配不够精确,无法鉴定至种甚至属的水平。Liu等首先将T-RFLP技术应用于微生物群落分析中,通过计算机模拟与实际群落分析比较表明,T-RFLP技术是用于评价并比较不同生态条件下微生物群落结构多样性的有力工具。Tom-Petersen等采用T-RFLP技术研究了铜污染土壤中的细菌群落结构多样性,结果表明,铜的添加能够显著改变整个土壤细菌群落结构,并对土壤中的根瘤菌-土壤农杆菌以及嗜胞菌类微生物的多样性产生影响。Kaplan和Kitts采用T-RFLP技术对石油污染土壤的修复过程中微生物群落动态学进行了研究,在修复进行的前3周,污染土壤中的石油被迅速降解,但在随后的21周内降解速度变慢;TRFs显示土壤中细菌群落结构的变化与石油降解速度的变化相一致。对不同修复时期的TRFs序列进行比对后可知,在石油快速降解期,黄杆菌属(Flavobacterium)、假单孢菌属(Pseudomonas)为土壤中的优势微生物类群,而在修复后期降解速度变慢后,这两个优势TRFs数量降低并逐渐被另外4个TRFs所代替。1.2.3土壤微生物群落多样性变化DGGE是特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳,可以分辨分子量相同或相近、碱基序列有差异的DNA片段。在DGGE凝胶中含有浓度线性递增的变性剂(尿素和甲酰胺),电泳中核酸片段在相应的变性剂浓度下发生空间构型变化,导致迁移率的不同,进而使核酸片段得以分离。DGGE的分辨率极高,理论上可分辨一个碱基的差异。由于DGGE具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点,近十年来已经成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具,被广泛用于土壤微生物多样性变化的研究。然而,该技术也有着大多数分子技术的缺点,如分析的片段较小(≤1kb)、条带的共迁问题以及PCR导致的突变等。Tu等采用PCR-DGGE技术分析比较了在植物修复多氯联苯(PCBs)污染农田土壤过程中土壤细菌群落结构与多样性的变化动态。在种植紫花苜蓿修复2年后的处理中发现许多新增的DGGE条带,经测序鉴定与信息比对发现,这些新增条带分别与已知的联苯降解菌Actinobacteria、Chloroflexi以及Proteobacteria属的微生物具有较高的同源性,提示紫花苜蓿的种植可显著改变植物根际土壤的微生物群落结构与多样性,促进联苯降解菌的生长与活性。张晶等采用PCR-DGGE方法,研究了土壤微生物群落多样性对生物表面活性剂强化的植物-微生物联合修复多环芳烃污染土壤的响应。结果表明,在鼠李糖强化紫花苜蓿-菌根真菌-降解菌联合修复过程中,土壤细菌群落多样性的组成和结构发生了不同程度变化,细菌群落中的优势及特征性条带分别与芽孢杆菌、鞘氨醇单胞菌和假单胞菌等种属对PAHs的降解密切相关。2logy的概念微生物群落本身是一个复杂系统,对单个微生物的研究已经不能满足人类对于微生物了解的需要,解答环境微生物生态学的关键问题需要系统的方法学。系统生物学(Systemsbiology)是研究一个生物系统中所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质等)的构成,以及在特定条件下这些组分间的相互关系,并通过计算生物学建立数学模型来定量描述和预测生物功能、表型和行为的学科。系统生物学的研究包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学和表型组学等,它们分别构成了生命信息传递的几个层次,在DNA、mRNA、蛋白质和代谢产物水平检测和鉴别各种分子并研究其功能。下面分别介绍土壤宏基因组学、宏蛋白质组学以及代谢组学这几个新兴“组学”技术的原理及其在污染土壤环境微生态功能中的应用。2.1建立土壤宏基因组信息库自1991年Pace首次提出环境基因组学的概念并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库以来,有关环境基因组学(也称微生物环境基因组学(Microbialenvironmentalgenomics)、宏基因组学、元基因组学(Metagenomics)、生态基因组学(Ecogenomics))的研究一直受到广泛关注。土壤宏基因组一般指土壤中所有细菌、真菌、古细菌、单胞藻、小型或微型原生生物的基因组总和。土壤基因组学的研究以基因组学技术为依托,其主要的程序包括从土壤中直接提取DNA并克隆至合适的载体中,再将载体转化到宿主细菌建立土壤宏基因组文库并对得到的文库进行分析和筛选。该方法应用之初是为了开发和利用土壤中那些不可培养的微生物资源,筛选新的生物活性物质和功能基因。近年来,土壤宏基因组学技术正逐渐渗透到农业、工业、食品、医药、能源和环境等各个领域。其中,土壤宏基因组学技术在环境保护和污染修复领域的应用主要包括两个方面:一是挖掘污染物降解基因和功能菌株,进行生物修复;二是分析微生物种群多样性,监测和评价环境健康。Sul等采用宏基因组学与DNA稳定性同位素标记相结合的方法,从受PCBs污染的沉积物中筛选具有PCBs降解功能的土著微生物及联苯降解基因。通过构建沉积物中土著细菌的13C-16SrRNA基因文库发现,沉积物中的优势微生物群落为不动杆菌和假单胞菌;同时对13C-DNA中的苯环双加氧酶基因进行PCR扩增并构建宏基因组文库,随后从该文库中分别筛选到两组与睾酮假单孢菌B-356菌株以及红球菌RHA1菌株有着较高相似度的联苯双加氧酶bphAE基因簇。研究结果提示,尽管许多联苯降解微生物尚不可在实验室条件下培养,但自然界中与联苯代谢相关的双加氧酶基因是普遍存在的。Liang等采用基于GeoChip基因芯片的土壤宏基因组学技术,比较了来自我国五个不同油田的受石油污染土壤中的微生物群落结构与功能基因多样性。研究结果表明,土壤中微生物群落的总体结构聚类与油田的地理分布有关,在所有的五个受污染的油田土壤中均能检测到高丰度的有机物降解基因,其中以烷烃和芳烃的单加氧酶和双加氧酶基因丰度最高。主成分分析结果表明,不同油田土壤中功能微生物的分布与当地土壤的基本性质,如石油污染物浓度、土壤氮磷含量、土壤含盐量以及土壤pH等因素有关。这一结果对阐明污染条件下土壤微生物的结构与功能变化有着重要意义,并为石油污染土壤的生物修复提供理论依据。2.2宏基因组学研究环境微生物功能1994年,澳大利亚学者Wilkins和Willhams提出了蛋白质组(Proteome)的概念,即一个基因组所表达的所有蛋白质,或细胞、组织或机体在特定时空所表达的全部蛋白质。2004年,Rodríguez-Valera根据宏基因组学的概念提出了宏蛋白质组(Metaproteome,或称元蛋白质组学),指环境混合微生物群落中所有生物的蛋白质组总和。尽管宏基因组学技术在微生物种群结构和生态环境功能的研究中取得了很大的成功,但其弊端也逐渐显现出来:由于重复基因的存在、基因表达的时空特异性和蛋白质修饰作用等原因,复杂环境条件下环境微生物基因特异性表达及其功能并不能通过宏基因组学的研究得到揭示,而这种信息往往是生态环境中最重要的部分。宏蛋白质组学的出现弥补了这个弊端,它能够通过检测某些蛋白质是否存在、相对丰度和蛋白质的修饰状态,直接测量功能基因的表达情况。通过对具有关键酶活性蛋白质的鉴定,可以使人们进一步认识在环境污染胁迫条件下微生物的代谢过程。然而,利用蛋白质组学研究复杂的微生物群体目前还存在一定的挑战,例如环境样品中蛋白质的有效分离,目前还没有统一的蛋白提取方法。在得到感兴趣的目标蛋白后,如何阐述其在生态环境中的功能动态也将是今后研究的热点之一。Singleton等采用宏蛋白质组学的方法比较研究了镉污染土壤中微生物量与土壤蛋白质表达的响应。研究结果表明,受镉污染的土壤中,土壤总蛋白含量显著低于未受污染的对照,SDS电泳分析表明,在镉污染土壤中明显存在大量小分子量蛋白的表达,提示镉胁迫可诱导土壤微生物合成表达低分子量应激蛋白(如金属硫蛋白)。此外,与微生物生物量法相比,宏蛋白质组学技术在研究土壤微生物生态功能中更敏感、更精确。Li等采用SDS、2D、MALDI-TOF-MS等技术,从蛋白质组学水平阐释了铜耐性修复植物海州香薷对铜吸收累积与耐性解毒的分子机理。研究结果表明,海州香薷适应缺铜和高铜胁迫时,均能够诱导一些功能蛋白(如氧化还原调控、细胞信号转导、转录与翻译调控、能量代谢调控、细胞壁代谢与细胞骨架调控、离子转运等相关蛋白)的差异表达,但这些蛋白在两种胁迫时处理Cu离子的机理不尽相同。2.3其它技术的联合应用代谢组学(Metabolomics)诞生至今不到10年,但发展非常迅速,现已成为系统生物学研究的一个重要组成部分。随着基因组学研究的深入,功能基因组开始研究基因组、转录组以及蛋白组的数据与表型之间的关系;而细胞内的全部代谢物最接近于表型,从而产生了研究全部代谢物的要求,代谢组(Metabolome)的概念由此诞生。后续研究过程中,代谢物组被定义为给定的生物系统在给定的条件下合成的所有的代谢产物。代谢物组学的分析是对一个生物系统中所有低分子量代谢物质的全面的定性和定量分析,通过考察生物体系受到刺激或扰动后,其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究生物体系的代谢途径。代谢组学分析中,对于不同类型的代谢产物,往往要采取不同的分析方法进行研究。目前,代谢物组学通常采用红外光谱法(IR)、核磁共振(NMR)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)以及各种技术的耦联,如GC-MS和LC-MS来分析研究代谢物并为其绘制图谱。随着基因组学的研究向环境微生物学中的渗透,代谢组学也逐渐被应用到微生物生态学的研究领域中,用于研究微生物群落多样性与微生物生态功能间的关系。微生物降解是修复环境中污染物的主要途径,深入了解污染物在微生物体内的代谢途径,将有助于人们优化微生物降解的条件,从而实现快速高效的生物修复。Luan等利用固相微萃取衍生化技术与GC-MS联用同时测定多种PAHs代谢产物的分析方法,开展了细菌和微藻降解PAHs的降解机理和代谢物动力学变化等研究。从单一菌株和混合菌群的培养基中以及菌体内,同时检测到PAHs多种单氧化和双氧化及其开环的代谢产物,发现多种PAHs降解过程中存在复杂的代谢物动力学过程;通过研究标志性代谢产物的组成与动态变化,揭示了代谢物水平上的微生物共代谢PAHs的降解机制。Mckelvie等采用核磁共振和GC-MS等技术,研究了化学杀虫剂污染土壤中爱胜蚓的代谢组学响应机制。研究结果表明,在DDT和硫丹暴露下,爱胜蚓的代谢产物麦芽糖、亮氨酸和丙氨酸的比例发生变化。当丙氨酸和甘氨酸的比例为1.5∶1时,可作为评价土壤受DDT和硫丹污染的潜在生物标志物。稳定性同位素探测技术(Stableisotopeprobing,SIP)是近期发展起来的将稳定性同位素标记技术与分子生物学方法相结合的代谢组学新技术。SIP技术的基本原理和技术路线为:将环境样品暴露于稳定性同位素标记的基质中,这些样品中存在的某些微生物能够以基质中的稳定性同位素为碳源或氮源进行物质代谢并满足其自身生长需要。基质中的稳定性同位素被吸收同化进入微生物体内,参与某些特定物质如核酸(DNA和RNA)及磷脂脂肪酸(PLFA)等的合成,通过提取、分离、纯化、分析这些微生物体内稳定性同位素标记的生物标志物,从而将环境中的微生物与其功能结合起来,以加深对不同