巴西橡胶树单染色体分离及其高通量测序分析的研究

煤炭及含硫模型化合物生物降解转化的研究专业：矿物加工工程姓名：邵雪嫚导师：张明旭教授安徽理工大学13级硕士研究生学位论文答辩报告报告主要内容课题来源立题依据国内外研究进展本研究的目的和意义研究内容研究方法和技术路线预期目标新颖之处所需解决的主要问题研究基础和条件研究进度及经费预算选题背景最近几年，由于煤炭的降解机理与降解酶有着直接的关系，所以煤炭的生物降解研究主要集中在白腐菌所产生的一系列降解酶，由此也联想到通过提高酶活性和产酶量来达到高降解转化率的目的。一般来说，MnP氧化大部分酚类、胺类等底物，LiP与其互为补充，氧化相对应的物质，而漆酶不仅可以氧化胺类物质也可氧化酚类物质[9,10]。微生物降解煤中有机硫研究已经取得很大的进展[11-12]，其中研究最多的属嗜硫菌对模型化合物DBT的降解，并且其确定了4S途径的降解机理[13]，对于其他含硫模型化合的研究较少，因此本课题研究了DBTO2的脱硫情况。1.课题来源基于基因工程构建煤炭降解工程菌降解转化煤炭的机理研究(51374014)

生物酶脱除煤炭中有机硫的机理研究（51474012）2.立题依据

橡胶是我国重要的战略物资。国内外已从橡胶中克隆了近420种基因或cDNA，然而这些基因基本均是从橡胶树cDNA文库或其总基因组中获得，无法确定其在橡胶树染色体上的位置和分布特点，从而导致无法进一步确定其所在的连锁群。研究者也先后发表了利用各种分子标记构建的橡胶树连锁遗传图，但均是从总基因组中获得，并存在着不同程度的连锁群不稳定，丰度小而且分布不均匀，许多功能基因在染色体组上的连锁关系和位置都不清楚，直接利用分子标记辅助橡胶树育种难度较大。3.国内外研究进展目前木质素降解酶已成为国内研究的热点，石开仪等人发现白腐真菌通过Lac和Lip的催化作用可以使百里酚脱酚基、脱甲基、开环、氧化等。何宝燕、尹华、彭辉等人研究了黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)对十溴联苯醚(BDE209)的降解；发现在含1mg/LBDE209的降解体系中，生物量为1.74g降解率达到最大(86.76%)；卢永等利用黄抱原毛平革菌对焦化废水进行降解研究，找到了降解的最优条件[19]；曾斌等研究了白腐真菌对五氯酚的降解情况[20]；这些都为进一步探索微生物对有机物的降解打下了基础。

研究内容

（1）紫外诱变对黄孢原毛平革菌酶活性的影响以及酶活性与降解率之间的关系。（2）微波诱变后的诱变菌的酶活性变化以及对低阶煤的降解状况。（3）紫外，微波处理的球红假单胞菌对DBT的降解状况及最适诱变时间。（4）利用响应面处理的方法探索影响DBT降解效果的因素。（5）球红假单胞菌对其他含硫模型化合物的降解。创新点

（1）目前，对于利用紫外、微波诱变方法，筛选诱变菌种已做了大量的研究工作，但是这两种处理方法对降解酶系的活性和产量有无影响，以及降解酶活性与降解转化率之间的关系还有待于进一步探索。（2）球红菌可以降解转化DBT已被我们所熟知，但是紫外或是微波处理后的菌种对其降解效果还未被探究。（3）球红菌对其他的含硫模型化合有无降解能力，降解效果如何，降解产物具体是那些等问题还未被探究。（4）首次利用响应面的方法探索了球红菌降解DBT的影响因素的最佳组合（5）结合生物酶提纯技术，首次探索了紫外，微波诱变处理后降解酶的浓度变化与酶活性变化。.

已发表的采用高通量测序的植物全基因组De

nove测序:

黄瓜(Cucumissativus)（HuangS等,2009）苹果(MalusdomesticaBorkh)(VelascoR等,2010)野生大豆(Glycinesoja)(KimMY等,2010)森林草莓（ShulaevV等,2011)、可可树(ArgoutX等,2011)麻风树(Jatrophacurcas)(SatoS等,2011)枣椰树(Phoenixdactylifera)(Al-DousEK等,2011)马铃薯(Solanumtuberosum)(XuX等,2011)白菜(Brassicarapa)(WangX等,2011)大麻(Cannabissativa)(vanBakelH等,2011)木豆(Cajanuscajan)(VarshneyRK等,,2012)蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)(YoungN等,2011)

橡胶树的全基因组De

nove测序目前还为发布。在植物方面对植物单条染色体进行高通量测序仅在小麦的单条染色体臂（聂小军等,2013）的研究中有过报道，在橡胶树中尚未见报道。

基因组测序只能测出整个DNA的碱基对排列顺序，不能直接测出DNA上的基因及其功能，必须通过生物信息学方法，结合蛋白组学、转录组学，对测出来的序列进行分析，将基因及其功能加以挖掘、注释，这称作基因注释。基因组注释主要包括四个研究方向：重复序列的识别；非编码RNA的预测；基因结构预测和基因功能注释。在国内外在植物方面已有对花生(陈华等,2009)、水稻(王宏斌等,2010)、大豆(王茵茵等,2010)、杜仲(李铁柱,2012)、构树(彭建军,2013)，拟南芥(张翔,2012,2013)等进行基因注释的相关报道。在橡胶树上的基因注释比较少。4.本研究目的和意义

本研究采用显微玻璃针分离技术对巴西橡胶树部分染色体进行单染色体显微分离，再利用单细胞全基因组扩增法对橡胶树部分单染色体进行体外扩增，并对其第二轮PCR产物采用Illumina/Solexa高通量测序技术进行测序，进而对相应染色体的序列进行序列分析、功能注释，从而进一步明确橡胶树已知的重要功能基因和预测功能的基因在橡胶树染色体组上的位置，初步对现有的橡胶树连锁群进行归类。

本项目可为筛选橡胶树染色体特异片段、单染色体或其区段的特异探针或特异标记，为构建橡胶树单条染色体功能基因的分离和定位及基因组物理图谱构建提供有效工具，从而有效的应用于橡胶树分子辅助育种。5.研究内容5.1巴西橡胶树热研7-33-97单染色体分离技术体系的建立。

主要通过借助显微操作仪的玻璃针分离法，进行巴西橡胶树热研7-33-97部分单条染色体分离和技术体系的优化。5.2单条染色体体外扩增与鉴定

采用单细胞全基因组扩增法对已分离出的巴西橡胶树染色体进行体外扩增，通过Southern杂交鉴定扩增产物来自巴西橡胶树基因组，经荧光原位杂交（FISH)验证并结合核型分析确定染色体序号。5.3巴西橡胶树单染色体PCR产物高通量测序与序列的功能注释

对已鉴定的单染色体第二轮的PCR产物进行Illumina/Solexa高通量测序，并对测序结果通过相应生物信息学分析进行其功能注释。如单条染色体测得的序列片段进行编号、片段大小分析，通过BLAST在线进行各橡胶树序列与基因库中橡胶树已知功能基因或未知基因序列比对，进一步明确橡胶树重要功能基因在橡胶树染色体组上的位置，同时对同源染色体的序列进行比对，进而分析同源染色体之间在DNA水平上可能存在的差异等。6.研究方法与技术路线6.1实验材料

本研究的主要实验材料是：黄孢原毛平革菌，球红假单胞菌，DBT。6.2研究方法1紫外诱变（1）首先打开紫外灯预热30min稳定光波取制备好的孢子悬液各6ml于9ml的平板培养平皿中，放在磁力搅拌器上，边搅拌边照射控制照射距离30cm。辐射处理时间梯度为：0s；20s；40s；80s；120s；160s；200s；250s。所有操作必须在红灯下进行，照射后的菌体不可直接接到平板培养基上，必须转入无菌试管中并立即放入无光照的冰水中1-2h，防止细胞修复，影响实验效果。（2）取上述诱变处理的菌悬液0.5ml均匀涂布于平板固体培养基上，四天后观察菌落生长状况，图片记录。将上述各自生长状况良好的菌落同上制成106/ml的孢子悬液，接1ml菌悬液于50ml的发酵液中，摇床培养7天后，分别取10ml样品装入小锥形瓶，加入各种酶提取用缓冲溶液（LiP采用缓冲液A，MnP采用缓冲液B，漆酶采用100mmol/L的醋酸钠缓冲液，PH5.0）振荡提取1h，150rpm。离心（4200rpm,20min），取上清液用0.45um滤膜过滤，滤液用于测定酶活。2微波诱变打开微波炉，选取中档功率，取制备好的106/ml孢子悬液30ml与锥形