水产甲壳动物免疫防御机能的研究进展

水产甲壳动物免疫防御机能的研究进展

甲壳动物的身体防御系统与动物和家禽一样，主要包括细胞和体液因素。由于一部分体液因子是在细胞内产生并发挥作用,所以将两种免疫防御因子严格区分是很困难的。对细胞方面主要测定血细胞和固着性细胞的吞噬活性,以及由血细胞产生的包围化及结节形成现象。对体液因子方面主要是酚氧化酶前体。1细胞免疫主要防御机能是通过吞食、包围化以及形成结节来实现的。此外,由固着性细胞产生的吞噬作用和胞饮作用也是甲壳动物重要的机体防御机能。1.1甲壳动物外周血细胞形态变化的方法血细胞命名比较混乱,主要原因是不同的研究者在研究甲壳动物血细胞时所使用的方法有所不同,因为不同的抗凝剂、缓冲系统、试验温度、采血方法、保存时间、固定方法等,均可以导致甲壳动物血细胞的形态、细胞内颗粒大小和着色性产生较大的差异,现在主要以内含颗粒大小来命名。1.2甲壳动物细胞免疫功能检测在水产甲壳动物中,具有清除外源蛋白类物质和病毒的胞饮能力的固着性细胞,主要有分布在鳃和触角腺的足细胞、附着在心脏和肌纤维上并且具有吞噬作用的吞噬性贮藏细胞和在连接肝胰腺细动脉的洞样血管内的固着性吞噬细胞。目前,在对甲壳动物细胞免疫功能检测指标大都集中在对血细胞的免疫指标的检测方面。其检测体系的检测指标大体包括:总血细胞数(THC)和不同类型血细胞数(DHC)、血细胞吞噬能力的测定、血细胞的超微结构、血细胞酶细胞化学指标、血细胞胞内酚氧化酶(PO)活性的检测等。1.3红细胞数目和血红蛋白计数1.3.1总血细胞数(THC)的测定血球计数板一般有两个计数室,每个计数室中刻有9个1mm2的大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个中方格,深度均为0.1mm。当计数室上方盖上盖玻片后,每个大正方形的体积为1mm2×0.1mm=1.0×10-4mL。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每mL血淋巴液中的血细胞数目。血细胞数/mL=4个大方格的血细胞总数/4×104×稀释倍数。1.3.2不同类型的血细胞数(DHC)的测定血淋巴液中吸取0.2mL置于另一支1.5mLeppendorf离心管中,加入5%的甲醛溶液0.2mL,混匀以固定血细胞。然后吸1滴血淋巴液在载玻片上推片,每只蟹做3张血涂片,晾干后用甲醇固定,蒸馏水冲洗后用Giemsa染色5~10min,水洗,用95%的酒精分色10~30s,再用蒸馏水冲洗,自然晾干,镜检。在油镜下,每张涂片随机选取100个细胞,进行透明细胞、小颗粒细胞和颗粒细胞的鉴定和计数。1.3.3血细胞存活率的测定(台盼蓝染色排除法)台盼蓝染料不容易穿过活细胞的质膜(因质膜完整)进入胞内使细胞着色,却能渗入到死亡的细胞内使其着色(死细胞被染成蓝色),因此可藉此鉴别死活细胞。1.4红细胞溶酶体酶细胞活性检测血细胞吞噬作用是最普遍的细胞防御反应,它与体液因子共同组成表皮的物理化学屏障,成为抵御寄生物或其他侵袭者的第一道防线。吞噬细胞产生的溶酶体酶能有效地降解和消除异物,血细胞的吞噬作用只有通过检测与吞噬作用相关的溶酶体酶如α-乙酸奈酯酶、β葡萄糖苷酸酶和酸性磷酸酶而间接地得到证实。血细胞溶酶体酶细胞化学变化作为甲壳免疫功能影响的评价指标之一。一般采用试剂盒法进行测定。其方法是:采集血淋巴制作血涂片,血涂片分别用购买的酸性磷酸酶染液,碱性磷酸酶(ALP)染色液,α-乙酸奈酯酶(α-NAE)染色液,β-葡萄糖苷酸酶染色液按试剂盒的说明进行染色制片,制片完毕后置光学显微镜的油镜下,随机选择100个血细胞观察、计数阳性血细胞的数量,阴性对照样品对照。用公式N(+)/N(total)×100%计算酶染色阳性反应的血细胞的百分率,N(+)为阳性反应血细胞的数量,N(total)为计数的血细胞的总数。在计数阳性反应血细胞时,分别统计无颗粒细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞的阳性反应细胞数量。1.5nbt还原法检测o2-产物利用活性氧作为杀伤分子的氧化性杀菌机制代表了一种古老的自然免疫反应,无论是植物还是动物中都存在这种防御机制。它主要是指吞噬细胞的呼吸爆发产生具有强大的杀菌活性的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)(O2-、H2O2、?OH、1O2),从而杀灭外来异物。NBT还原法测定O2-产物的原理是,当具有吞噬能力的血细胞受适当的刺激产生呼吸爆发时,氧分子经血细胞膜上的NADPH氧化酶催化,还原一个电子形成超氧阴离子(O2-),浅黄色的NBT经O2-作用后被还原成不溶的蓝黑色的甲臢(formazan),沉淀于血细胞胞浆内。此时,用KOH溶液裂解血细胞并用二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臢沉淀,最后可用比色法测定O2-的产量(以630nm波长吸光值表示)。NBT还原法已经广泛应用于测定甲壳动物血细胞中O2-的产生,相对于其他方法而言,NBT还原法灵敏度稍差,但具有快速、简便、可大量地进行样品分析的优点。1.6增设感染指数和事件指标将灭活的细菌或真菌注射到甲壳动物体内或将新鲜的抗凝血与菌悬液混匀后孵育一定时间,血淋巴经涂片、染色后显微镜下观察计数。可获得吞噬和杀伤百分率,吞噬和杀伤指数四个指标。吞噬率=(有吞噬作用的血细胞数/被计数的血细胞总数)×100%杀伤率=(含杀死的细菌的血细胞数/被计数的血细胞总数)×100%吞噬指数=血细胞内总菌数(死菌+活菌)/计数100个血细胞杀伤指数=100个血细胞内死菌数/100个血细胞内总菌数(死菌+活菌)1.7电镜叶片观察此方法要求条件比较高,电镜工作室的人员比较方便,一般都采取取样固定后送提供电镜制片观察方面工作的电镜测试中心进行。为了减少血凝过程对血细胞形态结构的影响,4℃预冷的PBS溶液配制的4%戊二醛固定液充分固定后备用。通过扫描电镜和透射电镜对细胞超显微结构的观察比较,从而对各种血细胞的结构与功能的变化做出判定。2体性因素的免疫2.1酚氧化酶原的激活酚氧化酶原激活系统被认为是目前甲壳动物免疫系统中最重要的一种免疫机制,酚氧化酶活力的强弱与机体免疫有直接相关性,可作为衡量甲壳动物免疫功能大小的一个指标。因此胞内酚氧化酶活性也可作为细胞免疫的一个指标。对酚氧化酶的活性的测定一般有两个指标,即未经胰蛋白酶处理的血细胞胞内PO活性的测定和血细胞胞内总PO活性的测定。甲壳动物的酚氧化酶原激活系统是由丝氨酸蛋白酶和其他因子组成的一个复杂的酶级联系统,无论从组成、激活方式还是从免疫功能上都非常类似于高等动物的补体系统。当病原微生物或寄生虫等侵入机体后,其细胞壁结构成分(如真菌中的葡聚糖和革兰阴性菌中的脂多糖等)作为非己信号按一定顺序激活丝氨酸蛋白酶,丝氨酸蛋白酶随后又激活酚氧化酶原,将其转变为活性的酚氧化酶,酚氧化酶是一种氧化还原酶,可氧化酚生成醌,醌自发形成最终产物——黑色素。黑色素及其形成过程中的中间产物均为高活性物质,通过多种方式参与宿主的防御反应,抑制病原体胞外蛋白酶和几丁质酶的活性,从而在伤口愈合、抑制甚至杀死病原体方面发挥着重要作用。它还可能作为调理素,促进血细胞的吞噬和包裹作用,介导凝集和凝固。无脊椎动物受伤后在角质层、细菌感染后在结节处以及寄生虫感染后的包囊形成过程中均有色素形成。现已发现黑色素和醌同时担当杀菌酶的抑制剂和制真菌剂的作用。甲壳动物的酚氧化酶原激活系统的因子是以非活性形式存在于颗粒和半颗粒细胞中。研究表明,proPO系统可以被多种物质所激活,包括来源于真菌的β-1,3-葡聚糖(β-1,3glucan,βG)和来源于细菌的肽聚糖(PG)、脂多糖(LPS)以及Ca2+、胰蛋白酶(Trypsin)、十二烷基肌氨酸钠(SDS)。另外,加热也可以激活proPO系统。这些物质是通过丝氨酸蛋白酶的作用而激活酚氧化酶的,而丝氨酸蛋白酶抑制剂能阻止这些物质对酚氧化酶原的激活作用。将血细胞破碎物上清液(HLS)作为酶源,并测定酶源的蛋白浓度。用96孔“U”底酶标板,在微孔中加入HLS和PBS,轻摇混匀后置湿盒中于28℃恒温水浴锅中温育30min,随后于每孔中加入L-3,4-二羟苯丙氨酸轻摇混匀后反应1min,再加入PBS(pH7.0)(预先于28℃下温育)。由200μL预温至28℃的PBS和100μLL-多巴组成的空白作底物单独自氧化的对照。将酶标仪的工作温度设定为28℃,固定吸收波长为490nm。将酶标板置于酶标仪中振荡4次,立即测定反应体系的初始光吸收值,然后每隔2min读取490nm处的吸光值。共读取10次(即试验反应周期设为20min)。空白对照为200μLPBS和100μLL-多巴。血细胞胞内总PO活性的测定只要将PBS换成50μL1mg/mL胰蛋白酶溶液即可。酶活力单位定义为:28℃下每毫克蛋白每分钟OD490增加0.001为1个酶活力单位。此方法繁琐,但可以比较有效地反应肌体免疫的强弱,是种有待推广的高效检测手段。2.2药物的溶血作用溶血素作为一种非特异性免疫防御因子,已在多种无脊椎动物血清中发现。但有关甲壳动物溶血素的研究,仅限于日本对虾、龙虾、蟹等。溶血素的作用可能类似于脊椎动物的补体系统,可溶解破坏异物细胞,参与调理作用,并可能与无脊椎动物的杀菌作用以及酚氧化酶原的激活系统有关。甲壳动物中的溶血素对热不稳定,并且可能被Ca2+螯合剂抑制,使其活性降低。无脊椎动物溶血素进行溶血作用的范围一般较广。溶血素具有溶解脊椎动物红细胞的功能,代表了其识别和排除异种细胞的能力,在甲壳动物的体液免疫中发挥重要的防御作用。2.3美龙虾的杀菌活性与昆虫相比,对甲壳动物血液中杀菌活性物质的研究报道很少。美洲龙虾的肝脏提取液及血清(包括血细胞成分)已经被证明具有杀菌活性,而且对美洲龙虾接种腐卵假单胞菌灭活菌苗后其杀菌活性会明显上升。血细胞的吞噬活性具有促进作用,所以他们认为甲壳动物的植物凝血素能在血细胞吞噬活动中起调理作用。2.4细胞崩解法溶菌酶又称胞壁质酶,它是一种碱性蛋白,主要杀灭革兰氏阳性菌,能够水解构成细菌细胞壁成分的多糖胞壁质中的N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键,从而使细菌的细胞壁破损,细胞崩解。在作用时可观察到溶菌现象,故因此而得名。溶菌酶广泛存在于各种动物的血细胞和血液中,在免疫活动中发挥着重要的作用。溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础,当吞噬细胞对异物颗粒进行吞噬和包囊后,细胞内的溶酶体会与异物进行融合,发生脱颗粒现象,外来入侵的微生物可以被其中的溶菌酶等直接杀死,随后再进一步将它们水解消化,并将水解消化后的残渣排出细胞外。溶菌活力可以作为检测对虾机体免疫功能状态的一个有价值的参考。2.5清除活性氧物质超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶,作为活性氧参与清除体内的自由基,在防御机体衰老及防止生物分子损伤等方面具有极为重要的作用。当微生物入侵被血细胞包裹后,机体产生一系列抗微生物物质,这些物质包括高活性氧种类,如超氧离子、过氧化氢、氢氧根离子和单线态氧。尽管氧是需氧细胞的必需成分,但同时,呼吸爆破中产生的高活性氧物质(ROS)也能引起潜在的细胞毒问题。因而有效而快速地清除活性氧物质是机体行使正常功能和存活的关键。这就由抗氧化防御机制来执行,其中包括超氧化物歧化酶清除超氧离子。近年来的研究表明,SOD的活性与生物的免疫水平密切相关。健康的生物体,其内环境中自由基的产生与消除处于平衡状态。SOD等酶具有消除自由基的功能,当SOD酶活性降低时,生物体内会出现自由基过多,势必扰乱、破坏体内一些重要的生化过程,导致代谢混乱,正常生理功能失调,体内免疫水平下降,潜在的病原被激活,使对虾发病。2.6不同氧状态的动物所产生的酚氧化酶血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白,每个氧结合位点有2个铜原子,其氧的结合位点与另一种铜离子结合蛋白——酚氧化酶的氧结合位点的结构具有很高的相似性。血蓝蛋白在脱氧状态为无色,结合氧为蓝色。它占甲壳动物血清总蛋白的60%~90%,在动物体内发挥着呼吸作用,为动物提供充足的氧量。其主要功能是氧的载体,此外还具有调节渗透压、储存蛋白质、脱皮激素转运和产生抗真菌肽等。而且,在胰岛素、SDS和肌体内凝集因子、抗菌肽等生物防御因子的作用下,能转化为酚氧化酶。血蓝蛋白裂解产生的抗微生物肽与对虾的免疫反应有关。虽然到目前为止,血蓝蛋白的加工机制还不十分清楚,但它们在甲壳动物免疫系统中所起的作用不容