脑缺血再灌注大鼠中枢元促肾上腺皮质激素样阳性免疫物表达的时间规律

脑缺血再灌注大鼠中枢元促肾上腺皮质激素样阳性免疫物表达的时间规律

根据最初的研究，促进肾上腺皮质激素（gac）是由垂体前和中叶细胞产生并分泌的一种促进激素。它的外部功能主要是调节肾上腺皮质酒精的产生和释放。后来发现,中枢神经系统也存在丰富的ACTH能神经元,其纤维投射遍及整个中枢。进一步的研究表明,ACTH在中枢具有许多不同于外周的生理、药理作用,如参与镇痛、增进学习和记忆、免疫调节、具有神经营养作用等,并认为通过直接影响脑而发挥其中枢生理、药理作用[2～4]。然而,脑缺血再灌注时中枢神经元ACTH表达变化却鲜见报道。为此,本研究采用免疫细胞化学方法探讨脑缺血再灌注不同时间段中枢几个重要脑区神经元ACTH样阳性免疫物的表达变化。材料和方法1.大鼠分组及造模方法雄性Wistar大鼠70只由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,大鼠体重180～200g。将70只大鼠随机分三组。正常对照组只;假手术对照组30只,行假手术;脑缺血再灌注组30只,颈动脉引流法全脑缺血再灌注造模。假手术对照组和脑缺血再灌注组又分术后6h、24h、72h三个亚组,每亚组大鼠10只。2.右颈总动脉血清酶颈动脉引流法全脑缺血再灌注造模。10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg),分离右股静脉和双侧颈总动脉。经右股静脉注入1%肝素(1.5ml/kg)并作插管备用,结扎右颈总动脉,经右颈总动脉结扎点远心端插入备用管,同时夹闭左侧颈总动脉,使右颈总动脉血经插管向右股静脉分流,7min后撤除插管并结扎止血,松开左颈总动脉复灌。假手术组麻醉后分离血管,经股静脉注入肝素,不作插管。3.脑内冠片制备各组动物分别于相应时间点深麻下开胸,先后分别用4℃生理盐水(200ml/鼠)、4℃4%多聚甲醛(500ml/鼠,磷酸缓冲液配制,pH7.4)经左心室冲洗和灌注固定,灌毕取脑,4℃后固定过夜,25%蔗糖溶液(磷酸缓冲生理盐水配制,pH7.4)4℃沉底。切取视交叉至乳头体后部平面脑段行恒冷箱冰冻连续冠状切片,片厚40μm。参照GeorgePaxinos鼠脑定位图谱,每脑取相当于前囟点(Bregma点)-1.40mm、-1.80mm、-2.12mm、-2.56mm、-2.80mm平面片共5张。4.抗兔igg,abc混合物按免疫细胞化学ABC法分步进行。主要试剂有:兔抗鼠ACTH(新西兰Watpa公司,效价1:3000),生物素化羊抗兔IgG(美国Sigma公司,效价1:500),ABC复合物(美国Sigma公司,效价1:500)。阴性对照用抗体稀释液替代一抗,其他步骤不变。常规贴片、脱水、透明、封片、镜检。5.小鼠海马cal区采用HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统进行图像分析。每鼠取脑片5张,400倍镜下检测各片顶皮质1区、下丘脑室旁核、丘脑室旁核、海马CAl区的ACTH阳性免疫面积(stainarea)、平均吸光度(density)。每片于每侧顶皮质1区、下丘脑室旁核、丘脑室旁核、海马CAl区相应部位各取3个视野(每片共计24个视野),每鼠各片各视野分别测定、累加取均值,即为该鼠中枢stainarea和density。终值单位为:像素点;检测场面积为15万个像素点。数据处理采用SPSSl0.0软件,差异显著性检验采用单因素方差分析,显著水平设为0.05。结果1.丘脑、麻黄区散在形态上的表现ACTH样阳性免疫物呈深棕色,深染胞核密集分布于脑片各区域,如皮质、海马、丘脑、下丘脑及尾壳核等。核呈圆形或椭圆形,依所在部位大小不一,边界清楚,未着色核仁清晰可辨。在丘脑、下丘脑区域,散在分布有深染呈“串珠”状阳性纤维,其中在丘脑室旁核及下丘脑室旁核等脑区纤维较为浓密,呈“织网”状,下丘脑室旁核等处有淡染、模糊的片状着色区(似胞浆着色);大脑皮质及海马区未发现阳性纤维存在。2.两组sta部位和density值比较以stainarea和density值为指标,比较结果见表1。假手术对照组、脑缺血再灌注组ACTH表达在不同时间段均出现显著性变化。术后6h假手术对照组、脑缺血再灌注组两组stainarea和density值均较正常对照组显著升高,术后24h达高点(P<0.05),然后逐渐回落,72h时接近正常值水平。在3个不同时间段,三组stainarea和density值均存在显著差异(P<0.05),术后6h及24h两个时间段,脑缺血再灌注组>假手术对照组>正常对照组;术后72h时间段,假手术对照组>正常对照组>脑缺血再灌注组。脑缺血再灌注损伤中相关acth表达的变化中枢神经系统存在丰富的ACTH能神经元,其纤维投射遍及整个中枢,ACTH胞浆阳性神经元存在于下丘脑室旁核、弓状核。本研究结果显示,中枢ACTH样阳性免疫物分布具有两个重要特点:(1)广泛分布于中枢神经细胞核中,仅在下丘脑室旁核、弓状核等处发现淡染、模糊的片状着色区,未见着色明显的胞体存在;(2)丘脑、下丘脑部分脑区存在有“织网”状阳性神经末稍,而大脑皮质区、海马均未见阳性末稍存在。本结果与有关报导基本一致但也存在一定差异。基于上述分布特点,推测ACTH可能具有更广泛的中枢作用,可能在神经元基因表达、功能调节、中枢内环境稳定等方面发挥重要作用,是一个应给予更多关注的重要的中枢效应物质。一般认为,ACTH在中枢具有许多不同于外周的生理、药理作用。如下丘脑ACTH能神经元参与机体休克、免疫等应激反应、中枢ACTH具有重要的神经营养作用、给予外源性ACTH可减轻低氧对海马脑片神经元突触传递功能的损害等。本实验采用免疫组织化学方法探讨脑缺血再灌注不同时间段下丘脑室旁核ACTH的表达变化,结果证实脑缺血再灌注损伤可诱导中枢ACTH强烈表达并表现出明显的时间规律。我们早期采用相同动物模型的研究证明:脑缺血再灌注状态下,大鼠顶皮质内锥体层神经元丢失高峰出现在再灌注24h～72h,随后幸存神经元密度基本稳定。上述相关的研究结果提示:下丘脑室旁核ACTH能神经元可能在脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用,脑缺血再灌注早期(6～24h)其ACTH的高度表达可能与神经元缺血保护作用密切相关。因此,在脑缺血再灌注早期积极采取措施诱导中枢内源性ACTH生成或使用外源性ACTH可能具有重要意义。ACTH相关肽的鉴别一直存在争议,由于ACTH抗体可与包含相同抗原决定簇的肽类结合,这些肽