一氧化氮合酶和雌激素受体在下丘脑诸核团的分布及共存

一氧化氮合酶和雌激素受体在下丘脑诸核团的分布及共存

脑瘫是神经分泌物的中心。雌激素的分泌和合成直接受脑瘫和垂体-腺体轴的直接控制。雌激素通过与其受体结合介导了下丘脑内重要功能,如对下丘脑-垂体-性腺轴的调控以及下丘脑内神经肽的表达和调控,还可通过影响多种神经递质的释放进一步影响神经元的功能。一氧化氮(NO)是一种气体信息递质,由一氧化氮合酶(NOS)合成,参与和介导了下丘脑的许多重要功能。如NO介导和调控催产素(OT)和加压素(VP)、促性腺激素释放激素(GnRh)的释放,以及其他神经递质的释放,并参与突触可塑性的形成。以往的研究表明NOS、雌激素受体(ER)阳性神经元在下丘脑分布广泛,有诸多共同分布区域,两者在功能上还有联系,本实验对下丘脑视上核内NOS和ER共存进行形态学的观察和研究,以期为进一步探讨NO与雌激素之间的内在联系提供形态学依据。1材料和方法1.1饲养的动物环境采用SD雌性大鼠30只(山西医科大学实验动物中心提供),体质量220～260g,将动物置于温暖、安静、避强光环境下饲养,使之适应周围环境。1.2酶抑制剂bbtER购自武汉博士德生物工程有限公司;硝基四氮唑蓝(NBT)购自上海生工生物工程技术服务有限公司;还原型辅酶Ⅱ-黄递酶(NADPH-d)由华美生物工程公司提供;SABC试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。1.3灌注pbs液大鼠麻醉后,经左心室升主动脉依次灌入生理盐水、4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)、10%的蔗糖PBS液,灌注后取脑,入4%的多聚甲醛液后固定3h,然后入20%的蔗糖PBS液(4℃)冰箱过夜。待脑组织浸泡沉底后取出,截取下丘脑部分脑组织,在冰冻切片机上做冠状面的连续切片,隔3取1,片厚约40μm。1.4染色将切片分成3套,一套行NADPH-d组织化学染色,一套行ER免疫组化显色,另一套行NADPH-d/ER双重染色。1.4.1羊抗兔igg片设计将经山羊血清孵育过的切片放入浓缩型兔抗ER血清(1∶100PBS稀释)中37℃恒温箱孵育3h,后置4℃冰箱过夜,入生物素标记的羊抗兔IgG液(即用型)中,37℃恒温箱孵育0.5h,入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37℃恒温箱孵育0.5h,PBS液漂洗3次,DAB显色后裱片制片。1.4.2-u-100,ml-nadph-d,0.5mg/ml-nadph-d-1.3%-1.3的合成将切片在0.01mol/L的PBS液漂洗3次后,入孵育液(孵育液组成:0.3%TritonX-100,1mg/mlβ-NADPH-d,0.5mg/mlNBT的PBS缓冲液)中37℃恒温箱孵育1.5h,用PBS缓冲液(pH7.4)终止反应,裱片制片。1.4.3正常化指标在NADPH-d染色的基础上再行ER免疫组化显色,用0.01mol/L的PBS液(pH7.4),漂洗3次,入正常山羊血清37℃孵育1h;以后步骤同ER免疫组化显色程序。1.5比较试验另取1只鼠脑冠状连续切片分4组,分别作以下反应:1.5.1抗感染试验空白试验:分别省去两套染色中的NADPH-d、兔抗ER血清,分别孵育切片。置换试验:用正常兔血清代替兔抗ER血清。1.5.2er免疫组化显色在行NADPH-d组织化学染色后,切片经PBS液漂洗,直接进行ER免疫组化显色中的DAB/双氧水呈色步骤,证实是否有残余的NADPH-d、NBT与DAB反应而导致反应产物混杂。1.6osol析pge毒片先于明视野显微镜下对各切片逐一观察,后用OlympusC-5050ZOOM数码相机在OlympusBH2显微镜下摄片。每只动物选片5张,每张切片测4个视野,在捷达801形态图像分析系统下进行细胞计数,分别计数下丘脑各核团内NOS阳性神经元数目,ER阳性神经元数目及NOS/ER双染神经元数目,并计算出双染神经元数占所有神经元的百分比。2结果2.1nos阳性神经元对细胞的分布NOS阳性神经元呈蓝色,细胞核不着色,胞体上的突起清晰可见。其中视上核、室旁核、下丘脑外侧区NOS阳性神经元数量较多,表达较强。在室旁核,NOS阳性神经元多分布在小细胞部,此处的NOS阳性神经元多呈卵圆形和梭形,胞体突起较长,多伸向第三脑室腔,有些突起呈“串珠”样外观(图1A)。小细胞部的NOS阳性神经元多集中分布在小细胞部的腹内侧区,在细胞分布密集处可见突起互相交织呈网状。大细胞部有散在NOS阳性神经元。在视上核,NOS阳性神经元密集成簇,以梭形细胞多见,胞体较大,胞质着色较深,胞核透亮,可见到突起交织成丛和“串珠”样外观(图1B)。在下丘脑外侧区,NOS阳性神经元多呈梭形,细胞突起较多且长,末端可见分叉现象,相邻细胞与细胞间突起密集交织成网状(图1C)。在室周核(图1D),NOS阳性神经元散在分布,呈卵圆形,突起清晰可见,有伸向第三脑室的“触液神经元”。2.2er阳性神经元ER阳性神经元在下丘脑诸核团的表达不及NOS阳性神经元广泛,主要分布在下丘脑视上核,室旁核和下丘脑外侧区,此外在室周核和大脑皮质也见到少量散在分布的ER阳性神经元。ER阳性神经元呈棕黄色,胞核着色,胞质不着色。视上核的ER阳性神经元多呈卵圆形,突起不明显,偶可见较短突起。少数细胞着色较深,绝大多数着色较浅,但细胞轮廓清晰,分布较密集(图2)。室旁核内的ER阳性神经元也有较强的表达与分布。细胞分布均匀,着色浅,轮廓清晰。在小细胞部,ER阳性神经元呈梭形或卵圆形,细胞突起不明显。此外,在下丘脑外侧区以及大脑皮质有少数ER阳性神经元,其中大脑皮质处ER阳性神经元呈锥形,突起明显,着色较深。下丘脑外侧区ER阳性神经元多呈卵圆形,突起明显,着色较深。2.3双染神经元胞体及形态NOS与ER双染神经元主要分布在下丘脑的室旁核、视上核、下丘脑外侧区及室周核。其他区域可见到散在分布的双染神经元。在视上核,低倍镜下可见蓝染的NOS阳性神经元和散在其中的淡染的呈棕黄色的ER阳性神经元以及大量的双染阳性神经元。NOS和ER双染神经元胞质呈蓝色,胞核呈棕黄色。高倍镜下,NOS神经元着色深,呈蓝或蓝黑色,密集成簇,胞体上发出的突起清晰可见。少数细胞突起较长,直径较粗,多伸向视交叉腹侧,与远端的双染神经元突起交织在一起,可见明显的“串珠”样外观(图3A)。ER神经元着色淡,多散在分布,胞体多呈梭形或椭圆形,可见到有突起发出,但数目不多,偶可见到突起相互交织。双染神经元胞核呈棕黄色,有的透亮,胞质蓝染,细胞多呈梭形或椭圆形,突起明显,呈“串珠”样外观。在少数双染的阳性神经元中,还可见到胞核内深染的核仁(图3B)。视上核双染神经元胞体较大,直径达20μm左右,多为大细胞型神经元。NOS及ER双染阳性神经元多位于视上核的背外侧和背内侧部。在视上核内双染神经元占70%～80%。在室旁核,双染神经元在小细胞部腹内侧区分布较密集,在大细胞部后外侧区呈散在分布。双染神经元胞质染成深蓝色,胞核呈棕黄色,也有少数细胞胞质着色浅,胞核显得较大。神经元突起较视上核短粗,分支较多,在一些区域可见突起交织成丛,也可见到“串珠”样外观(图3C)。在小细胞部腹内侧区双染神经元突起多和邻近的细胞突起交织在一起,不易分辨。细胞呈卵圆形或梭形。在小细胞处密集的双染神经元间,可见散在分布ER神经元,细胞轮廓清晰,呈卵圆形或椭圆形,突起不明显,胞体截面与视上核相似或略小。NOS阳性神经元突起明显且长,也多与邻近细胞交织在一起。它们的突起多伸向第三脑室。也可见到“串珠”样外观。小细胞部双染神经元占80%～90%以上。在大细胞部后外侧区见到少数散在的双染神经元,胞体直径较大,胞核与胞质之比大于小细胞部,胞核内可见浓染的核仁,细胞的截面呈椭圆形,突起不明显。在下丘脑外侧区,NOS与ER双染神经元表达较强,且分布较广。细胞形态多为椭圆形或卵圆形,突起明显,双染神经元突起多,伸向远处,胞核较大呈棕黄色,核仁清晰可见,核/质比大(图3D)。ER阳性神经元的胞体较大,多呈梭形,胞核着色深,无明显突起。NOS阳性神经元多散在分布,在视上核、室旁核和下丘脑外侧区3个核团中所占比例最少,但突起较长。在室周核,可见零散分布的双染神经元,多为卵圆形,胞核偏于一侧,棕黄色淡染,胞质着色深,突起伸向远端,多与远侧NOS神经元交错。3讨论3.1采用20d细胞体外培养国内外资料显示,雌激素在中枢和外周神经系统有一个广泛的生理学效应,这些效应是通过NO介导和影响的。资料表明,NO在雌激素对神经组织的作用上是一个很重要的介质。研究进一步显示,在人的SK-N-SH细胞体外培养中显示雌二醇(E2)能诱导NO产生,并且E2是通过活化原发性一氧化氮合酶(cNOS)而产生NO的,这个过程受细胞内外Ca2+调控。NO是雌激素作用ER后,产生的第二信使,从而介导和完成了雌激素的作用。本实验结果表明在下丘脑室旁核、室上核、室周核、下丘脑外侧区均可见NOS与ER双染神经元,为NO介导雌激素受体的作用提供形态学依据。3.2nos与er神经元的调节室旁核的神经元可分为大细胞和小细胞两种分泌神经元。大细胞分泌OT和VP。视上核主要含有大细胞分泌神经元,主要分泌的也是OT和VP。国外研究表明NOS与VP和OT神经元分布有共存。在成年大鼠下丘脑神经垂体系统中NADPH-d可与OT及VP共存,NO能调节VP和OT的释放。在等渗、有效循环血量正常时,NO抑制OT和VP的分泌;当失血、脱水、血容量减少时,NO对VP神经元抑制作用减弱,而对OT神经元抑制却加强了。其作用机制是优先释放VP,对抗或代偿身体水分的失衡。在去势大鼠,45%～98%的OT与88%～99%的VP神经元含有ERβ受体,ERβ和VP神经元共存于视上核背外侧部、室旁核大细胞部后外侧区。ERβ与OT神经元主要分布于室旁核内。在高渗状态下ERβmRNA表达下降,同时ERβ也下降,表明ERβ对渗透压改变呈负相关。可以看出,NO和ER对OT和VP的分泌都起到了调控的作用,两者对VP的调节都呈负向的调节。有报道表明,睾酮、双氢睾酮、皮质醇同样可以抑制因渗透压改变引起的VP释放,类固醇激素对因渗透压改变引起的VP释放的抑制作用很可能是通过兴奋性氨基酸(谷氨酸)来介导完成的。NOS与谷氨酸受体在下丘脑神经垂体轴及室周器分布广泛,γ-氨基丁酸对大细胞型神经分泌细胞的神经支配在此处也较广。其机制为谷氨酸通过与N-methyl-D-aspartate(NMDA)型谷氨酸受体结合后使NO释放,进而使γ-氨基丁酸能神经元活性增加,抑制大细胞型神经分泌细胞分泌OT和VP。结合本实验结果,NOS与ER神经元在室旁核和视上核共存,主要分布在视上核的背内侧、背外侧部,室旁核的大细胞部后外侧区,此处的大细胞正是分泌OT和VP神经元处。我们推测ER对OT和VP的调节是通过NO来实现的。3.3no、er双染神经元/gnrh表达GnRh神经元在下丘脑内分布较分散,主要分布在室周核、弓状核、腹内侧核、室旁核小细胞部腹内侧区、视上核等。雌激素对GnRh释放神经元除了有负反馈调节外,也展示了一个积极的正反馈调节,进而促使LH释放和排卵作用。国外研究资料表明GnRh上有ERβ受体,在GnRh神经元中有galanin蛋白表达,galanin是促GnRh释放因子。雌激素可通过与其受体结合促进galanin蛋白表达进而调控GnRh释放,而galanin与NOS共存,提示两者在促GnRh释放上联系紧密。NO在应激和神经内分泌中有重要作用,NO参与了性行为和GnRh/LH的释放。在去势鼠给予雌激素治疗后,腹内侧核的腹外侧区NADPH-d(NOS)阳性神经元数目增多,可见,NO参与和介导了雌激素对GnRh作用。本实验观测到:NOS与ER双染神经元存在于室周核及室旁核小细胞部腹内侧区,正是GnRh神经元分布所在部位。ERβ和NOS共存于一个细胞,从形态学上显示雌激素对GnRh释放的调控是通过NO介导实现的。有学者通过下丘脑基底内侧核体外培养实验表明,用E2治疗后促使GnRh的释放是由NO介