温敏性壳聚糖-甘油磷酸钠-胶原水凝胶的制备及其与脂肪间充质干细胞的生物相容性

温敏性壳聚糖-甘油磷酸钠-胶原水凝胶的制备及其与脂肪间充质干细胞的生物相容性

组织工程包括将具有特定性能的三维生物支撑材料移植到具有特定性能的三维生物支撑中，进行培养，并将其移植到受损组织中以修复受损组织。支架主要分为多孔支架（硬支撑）和可注射支（软支撑）。可注射水凝胶支架属于软支架，具有简单的原胶、随机的塑料形状、简单的操作和较少的伤口，引起了人们的注意。含壳聚糖的生物支架由于具有生物相容性良好、无免疫原性和可生物降解等优良性能而被广泛应用于基础生物医学与临床领域.研究表明,壳聚糖与β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate,GP)可混合制成一种可注射性支架,壳聚糖与GP的混合溶液在室温下为液态,注射到体内时会变为凝胶.这种水凝胶由于GP的离子浓度过高其细胞相容性较差而使得其应用受到限制.Cho等在水溶性壳聚糖上接枝异丙基丙烯酰胺制得的水溶性共聚物为不透明松散凝胶,但是异丙基丙烯酰胺的体内降解性和生物相容性还需要进一步探究.另一种水凝胶是聚(氧化乙烯-氧化丙烯-氧化乙烯)体系,但体内实验显示此聚合物有毒性且不能生物降解.因此上述材料均不能满足生物相容性要求.胶原是一种天然蛋白质,为迄今为止最理想的细胞生长基质,具有低免疫原性和特殊的生物相容性、生物可降解性,是最早被应用的天然生物材料.胶原具有特异性的分子识别信号,可促进细胞的黏附和增殖,诱导细胞分化并为细胞生长提供支架.胶原在体内降解为各种氨基酸,安全无毒、无致敏源、无刺激.同时胶原也具有体温成胶的特性,但是其在体内降解过快而且力学强度较低.本文尝试将壳聚糖、β-甘油磷酸钠与胶原混合后制备一种新型的温敏性可注射水凝胶支架(C-GP-Co),并对脂肪间充质干细胞(ADSCs)在C-GP-Co水凝胶支架的生长、增殖和分化进行研究.1实验材料和方法1.1型胶原酶、壳聚糖的合成实验所用材料和仪器如下:鼠尾胶原(广州创尔生物技术有限公司)、高糖DMEM培养基(GIBCO)、胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)、β-甘油磷酸钠及Ⅰ型胶原酶(Sigma)、壳聚糖(脱乙酰93%,济南海得贝海洋生物工程有限公司)、Live/DeadViability-Cytotoxicity试剂盒(Invitrogen);倒置荧光显微镜(IX71Olympus)、扫描电镜(日立S2520)、数字彩色摄像系统(Sony3CCD)、图像分析系统(Image-pro-plus)、渗透压仪(Wescor)、pH计(Benchtop)、SRKLYOVACGT2-9冷冻干燥机(LABCONCO).1.2sdcs的纯化脂肪组织由大连沙医生美容整形医院提供并经患者同意.取400～600mg人皮下脂肪组织用D-Hanks缓冲液冲洗几次,加入与脂肪组织等体积的胶原酶和胰蛋白酶混合液(胶原酶与胰蛋白酶的体积比为1∶1)于15mL离心管中,加盖并在37℃下190r/min的摇床中振荡消化20min,溶液分3层,下层为单个核细胞的酶溶液层,中间层为絮状脂肪组织层,上层为黄色油状脂肪细胞层.吸出最下层液体并移入含10%胎牛血清的高糖DMEM的离心管中终止消化.剩余的脂肪重复上述操作2～3次,将收集到的混合液置于离心管中,1500r/min下离心10min后弃上清,加入含15%胎牛血清的DMEM重悬后接种在培养瓶中,放入37℃、5%CO2培养箱中培养,24h后首次换液,以后每3d换一次液,7d左右细胞达95%以上融合时传代.取4代以后纯化的ADSCs备用.1.3荧光标记抗体检测细胞流式细胞1000r/min下离心5min,用PBS缓冲溶液洗涤一次,收集ADSCs,制备105个/mL的单细胞悬液.取2支离心管,每管加入1mL细胞悬液,1000r/min离心10min后每管加入1.5mLPBS混匀,1000r/min再次离心5min,弃上清后分别加入荧光标记抗体CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FICT、CD105-FICT和HLA-DR-PE,4℃下避光孵育30min,结果用流式细胞仪检测并由Cell-Quest软件分析(每个样本至少分析10000个细胞).1.4诱导分辨率检测abss取第6代细胞,以1.0×105个/mL的密度接种于24孔板置于培养箱内培养,待细胞贴壁后备用.1.4.1细胞形态观察和染色在成脂诱导培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+0.5mmol/LIBMX+10μmol/L胰岛素+1μmol/L地塞米松+1%青链霉素原液)培养下诱导分化2周,期间每2d换液一次,用相差显微镜观察诱导后的细胞形态变化并进行油红O染色.1.4.2细胞表型观察和甲苯胺蓝染色成软骨诱导培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+6.25mg/L胰岛素+10μg/LTGF-β1+50nmol/L抗坏血酸+1%青链霉素原液)诱导分化2周,用相差显微镜观察诱导后的细胞形态并进行甲苯胺蓝染色.1.4.3-甘油磷酸钠+0.mol/甲基地塞米松细胞的alp染色取孔板中的6孔细胞,加入成骨诱导剂(DMEM+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+50μmol/L维生素C+100nmol/L地塞米松)培养.细胞在诱导培养基中培养一周后取其中3孔进行ALP染色,其他3孔进行vonKossa染色.1.5壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶的成胶时间将适量壳聚糖(平均相对分子质量为5000)粉末溶解于0.1mol/L的乙酸溶液制成体积分数2.2%的壳聚糖溶液,过滤除菌后置于冰浴中保存.β-甘油磷酸钠粉末溶于三蒸水中配成质量分数50%溶液,过滤除菌.在冰浴下,按不同体积比将β-甘油磷酸钠滴加到壳聚糖溶液中,充分搅拌,制成C-GP溶液.由于配制的壳聚糖-甘油磷酸钠溶液中两者的体积比不同,所得溶液的pH及成胶时间也是不同的.采用电子pH计测量不同体积比的壳聚糖-甘油磷酸钠溶液的pH.取1mL壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶体系加入小试管中,放入37℃气浴中,每2min检测(将小试管倒置)直至体系不流动时所经历的时间即为壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶的成胶时间.1.6c-gp-co水凝胶的制备冰浴下向400μL胶原中加入480μL三蒸水,然后加到24μL0.1mol/LNaOH溶液中,最后加入100μL10×PBS后充分搅拌,制得2mg/mL的胶原溶液,冰浴保存.将上述配制好的C-GP溶液与胶原溶液分别以3∶7、5∶5和7∶3的体积比混合制取可注射C-GP-Co水凝胶.以每孔120μL的量将C-GP和C-GP-Co水凝胶接种在96孔板中,37℃下成胶15min后放入-80℃冰箱中预冻2h后置于冷冻干燥机内干燥48h,真空喷金后用扫描电镜拍摄扫描照片(加速电压为40kV).1.7细胞生长特性的测定分别将10μL/孔的C-GP-Co和C-GP水凝胶加于96孔板中,两种水凝胶各使用21孔,在37℃培养箱中成胶.将第9代人吸脂来源的脂肪干细胞制成密度为8×104个/mL的细胞悬液,接种于上述42个孔中,最后接种21孔无水凝胶作对照组.63个孔中每孔加入细胞悬液100μL,移入培养箱中培养7d(每3d换一次液),并随时用倒置荧光显微镜观察细胞生长状况.第2d起,用CCK-8试剂盒每天每组取3孔细胞用酶标仪测其吸光度.将50μL/孔的C-GP-Co水凝胶、C-GP水凝胶加入24孔板,放入37℃培养箱中成胶.将第9代人吸脂来源的脂肪干细胞制成8×104个/mL的细胞悬液以650μL/孔的量接种于上述孔板.第3d和第7d时用Live/DeadViability-Cytotoxicity试剂盒染色以观察水凝胶中细胞的死亡状况.1.8培养基的渗透率测定分别将30μLC-GP-Co水凝胶溶液和C-GP水凝胶溶液加入96孔板,37℃下成胶1h后加入100μL培养基过夜.用渗透压仪测定C-GP-Co水凝胶和C-GP水凝胶中培养基的渗透压并与标准培养基的渗透压对照.1.9数据的统计分析实验均平行3次,统计结果用Origin7.5软件处理,用t-检验确定显著性水平,并用“平均值±标准偏差”表示.2结果与讨论2.1细胞诱导和免疫在倒置相差显微镜下观察,脂肪单个核细胞的培养瓶中细胞多数为圆形.原代ADSCs培养24h后有少数单个细胞贴壁生长,呈多角形、圆形或长梭形散布于瓶底.培养至第7d时,少数细胞为圆形或多角形,大多数贴壁细胞呈长梭形,见图1(a)～(c).脂肪干细胞诱导分化能力鉴定:①成骨诱导.细胞诱导1周后,形态由长梭状向扁圆形转变,深浅不一的黑色区域为被ALP染色的成骨细胞,见图1(d).②成软骨诱导.成软骨诱导培养基中诱导培养后,单个细胞形态并无明显变化.随诱导时间延长,在细胞密度较大处细胞呈颗粒状.2周后,甲苯胺蓝染色时软骨细胞外基质被染为蓝色,如图1(e)所示(图中深色部分).③成脂诱导.成脂诱导培养后细胞由长梭形变为不规则圆形,细胞体积增大且大小不一.诱导后4d时可在细胞内观察到小脂滴,随后小脂滴逐渐增多并汇合成大脂滴.诱导培养2周时,细胞分化达到高峰.油红O染色结果见图1(f).实验选择特异性表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105以及HLA-DR进行了免疫表型检测.结果发现本研究分离培养的细胞均表达间充质细胞的表面标志分子CD44、CD105,而不表达造血细胞的表面标志分子CD34、CD45和HLA-DR.说明了本研究中分离培养的ADSCs经传代培养后仍能保持其干细胞表型,见图2(a)～(f).2.2壳聚糖与-甘油磷酸钠成胶溶液ph的变化壳聚糖与β-甘油磷酸钠溶液不同体积比混合得到的C-GP溶液的pH及水凝胶成胶时间见表1.由表可以看出,随着β-甘油磷酸钠比例的增加,成胶时间减少的同时体系pH升高,此结果与Chenite等的报道基本一致.本研究还发现,若将磷酸氢二钠的溶液加入壳聚糖溶液中,在pH大于6.3时,有白色沉淀出现且可在室温成胶,分析其具体作用机理:壳聚糖链被β-甘油磷酸钠的多醇基团分开从而加快了其分子周围水壳层的形成,壳聚糖链的保护性水合作用形成使得低温中性环境下壳聚糖链不能缔合.但随温度升高,壳聚糖链间的疏水作用和氢键作用逐渐增强,溶液中开始出现物理交联区,凝胶得以发生.从表1中可以看出,壳聚糖与β-甘油磷酸钠混合溶液pH为7.16,体积比为5∶1时,成胶时间为10min,而且此时胶原的引入基本不影响成胶时间及水凝胶的pH,因此下述实验所需的壳聚糖与β-甘油磷酸钠水溶液均采用该比例.2.3壳聚糖--甘油磷酸钠-胶原的含量对其降解c-gp-co水凝胶的影响将上述C-GP溶液与胶原溶液分别以7∶3、5∶5和3∶7的体积比混合,成胶时间分别为12、12和14min.所得溶液置于37℃下成胶(室温下为液体状),见图3(a)、(b)(图中水凝胶C-GP溶液与胶原溶液体积比为5∶5).考虑到胶原溶液占总体积的比例与水凝胶的降解速率成正比,以下实验C-GP-Co水凝胶均采用1∶1的体积比配制,即壳聚糖-β-甘油磷酸钠-胶原体积比为5∶1∶6.扫描电镜观察C-GP和C-GP-Co水凝胶内部均为海绵状多孔结构,见图3(c)、(d).但C-GP-Co水凝胶内部的孔道更加致密均匀、连贯,直径范围为100～200μm,而C-GP水凝胶的孔道不规则、松散,直径更大.分析其原因:随温度升高,壳聚糖分子表现为疏水并聚合成更大的分子从溶液中析出,导致壳聚糖分子在溶液体系中的分散度降低,从而形成了更大的空隙.由于胶原不参与壳聚糖分子聚合,胶原的加入可以有效填补壳聚糖聚合留下的空隙,使形成的水凝胶内部孔道更小且致密.另外,本研究还发现,加入胶原后C-GP水凝胶强度有所加强,这也是C-GP和C-GP-Co水凝胶内部结构不同导致的结果.2.4c-gp-co水凝胶中活细胞的增殖情况本实验测定了C-GP水凝胶提取培养基、C-GP-Co水凝胶提取培养基及标准培养基的渗透压,结果见图4.β-甘油磷酸钠为可溶性盐,故有大量离子解离并溶解到周围溶液中,所以C-GP水凝胶提取培养基的渗透压最高,对细胞的生长最不利,超过370mmol/kg.胶原本身不解离离子,所以C-GP-Co水凝胶提取培养基的渗透压次之,标准培养基的渗透压最低.虽然C-GP-Co水凝胶中的渗透压高于标准培养基,但仍在细胞可耐受的渗透压范围内(240～370mmol/kg).第7d时用倒置荧光显微镜观察3组细胞均呈长梭状生长,见图5(a)～(c).C-GP-Co水凝胶组比C-GP水凝胶组的细胞形态好,数目多.实验组由于含有甘油磷酸钠溶液而对细胞有一定的毒性,所以对照组的细胞形态最好,数量最多.采用CCK-8法测得细胞增殖情况,C-GP-Co水凝胶组吸光度随时间增长而增高,且明显比C-GP水凝胶组吸光度高;对照组的吸光度最高并保持增长;C-GP水凝胶组吸光度随时间增长稍有降低.这说明C-GP-Co水凝胶组细胞能够不断增殖,并且增殖情况明显好于C-GP水凝胶组,C-GP水凝胶组细胞数量随着时间延长而有所降低,对照组细胞增殖情况最好,见图6(a).对8个随机的显微镜视野内两种水凝胶中活细胞数量进行人工计数分析,结果见图6(b).第3d、第7d时C-GP-Co水凝胶中活细胞的数量无明显变化,但均高于C-GP水凝胶中活细胞数量,而C-GP水凝胶中活细胞数量略有降低,统计结果与CCK-8法检测结果保持一致.两种水凝胶中脂肪间充质干细胞的Live/DeadViability-Cytotoxicity试剂盒检测结果见图7.第3d时C-GP-Co水凝胶中生长的细胞呈长梭状,形态良好,只有少数细胞调亡;而C-GP水凝胶中只有少数细胞呈伸展状态,死亡细胞也比较少,原因是染色时部分死亡细胞被缓冲溶液冲洗掉.第7d时,C-GP-Co水凝胶中死亡细胞数量稍有增多,但活细胞数量与之相比更多并呈伸展状态,而C-GP水凝胶中的活细胞有减少的趋势,细胞状态差,死亡细胞数量明显增多.由以上实验结果可以看出,由于C-GP水凝胶中含有较高的离子浓度,对细胞造成了一定的毒性作用,同时由于壳聚糖对细胞的亲合力比胶原差,C-GP水凝胶细胞的生长状态和活率均小于C-GP-Co水凝胶.而胶原作为组织工程支架材料,虽强度较差、降解速度较快且不能与细胞的生长速度保持一致,但是具有很好的细胞亲合力,可促进细胞的黏附和增殖.通过将C-GP水凝胶与胶原混合制成C-GP-Co水凝胶,能够使材料对ADSCs的亲合性增强.另外壳聚糖带正电荷,胶原带相反电荷,故两者可通过静电作用使胶原的降解速度降低.2.5克氏原螯虾中的脂肪细胞的活性工程组织的体外构建需要种子细胞与支架复合后构建成为新组织,前述结果表明ADSCs在C-GP-Co水凝胶表面能够很好地生长增殖,但还需要ADSCs在水凝胶内部生长增殖后仍能保持分化潜能.在成脂诱导培养基中培养14d后,倒置显微镜及油红O染色照片见图8(a)、(b),诱导5d后即可在显微镜视野下观察到长梭状干细胞中出现小的圆形脂滴,随时间延长,脂滴变得越来越多.油红O染色后,细胞内有大量红色脂滴出现,表现出脂肪细胞的特征,这说明C-GP-Co水凝胶表面生长的脂肪干细胞已被诱导分化为脂肪细胞,ADSCs在C-GP-Co水凝胶上培养后仍有分化能力.图中所见圆形脂肪细胞均较小且活性较强:从第5d脂滴开始出现到第14d观察结束时没有出现脂滴破裂或细胞死亡情况,而从人体内直接分离出的成体脂肪细胞体积大、活性差,培养7d左右时脂滴破裂,细胞死亡.2.6c-gp-co水凝胶内部的电镜观察由于C-GP-Co水凝胶中含有细胞亲合性很好的胶原,可见大量ADSCs呈伸展状相互连接在一起,并且ADSCs