运动训练改善心衰大鼠室旁核-氨基丁酸b型受体介导的交感出入口抑制性作用机制

运动训练改善心衰大鼠室旁核-氨基丁酸b型受体介导的交感出入口抑制性作用机制

交感神经系统激活是慢性心力衰竭的重要病理特征，也是导致心力衰竭和心力衰竭患者死亡的重要因素。有研究报道,规律性的运动训练有益于心衰患者的身体康复,心衰患者经过长期的规律性运动训练,不但可以提高生活质量而且可降低死亡率.在动物实验中发现运动训练可提高心衰动物动脉压力感受性反射的敏感性,进而降低心衰状态下的交感兴奋增强作用.另有研究显示,运动训练可通过增加心衰大鼠下丘脑室旁核一氧化氮合成酶的表达量,进而改善心衰状态下由NO所介导的交感神经抑制性作用而减少心衰状态下交感神经系统的激活作用.进一步的研究还发现室旁核内NO对肾交感神经放电的抑制作用是通过GABA发挥作用的.而在心衰状态下由内源性GABA所介导的对肾交感神经的抑制作用与正常大鼠比也明显减弱,结果提示这一功能性的改变有可能是引起心衰大鼠交感神经系统激动增强的重要机制之一.纵观以上研究,我们拟使用冠脉结扎法建立心衰大鼠模型,通过对心衰和假手术对照大鼠进行长期游泳训练,观察运动训练改善心衰状态下室旁核内源性GABA所介导的对肾交感神经放电的抑制性作用,并进一步论证运动训练增加心衰大鼠室旁核GABAB受体mRNA表达量可能是其中的重要分子机制.1材料和方法1.1实验动物及仪器Wistar大鼠,雄性,体重180～200g,由吉林大学实验动物中心提供.肝素钠购于北京鼎国生物技术有限责任公司.α-氯醛糖;CGP35348;滂胺天蓝均购于Sigma-Aldrich公司.2实验方法2.1假手术组和心力衰竭训练组大鼠游泳训练实验Wistar大鼠随机分成4组,即假手术安静组(n=8)、假手术训练组(n=6)、心衰安静组(n=8)和心衰训练组(n=8).在乙醚麻醉下将大鼠仰位固定于手术台,自左侧3～4肋间开胸,暴露心脏,于肺动脉圆锥及左心房间找出冠脉左前降支,以0号线立即结扎,将心脏送回胸腔,并挤出胸腔内血液和气体,迅速关闭胸腔,开胸时间不超过30秒.假手术组仅置缝线而不结扎.术后前3天,肌注青霉素,术后第4周对假手术训练组和心衰训练组大鼠行游泳训练实验.2.2运动训练假手术训练组和心衰训练组大鼠被放入一个圆柱状筒(直径120cm,高80cm)内进行游泳训练,筒内放一温度计控制水温在30～32℃.动物每天上午9:00～10:00被放入筒内,由同一个人监控游泳,每只鼠起初游泳适应性训练15分钟/天,为保证游泳训练的效果,1周后训练时间增至60分钟/天,连续训练4周.每次训练结束后,用电吹风机吹干鼠毛.安静组大鼠除不经受训练外,其他处理与训练组大鼠相同,而游泳训练假手术组和游泳训练心衰组的运动量保持一致.在最后一次运动训练过后,20～24小时内进行大鼠的急性实验部分.2.3肾神经传导检测指标(LVEDP)、左心室最大收缩舒张速率(dP/dt)、肾交感神经传出放电活动(RSNA)、血压(ABP)和心率(HR)的记录动物腹腔注射乌拉坦(0.75g/kg)和α-氯醛糖(70mg/kg)麻醉,如需要可静脉补充α-氯醛糖(0.3g/kg)麻醉,右颈总动脉插管,通过压力换能器连接到生理记录仪,同步采集LVSP、LVEDP和±dp/dtmax各项指标,记录完左心室舒张末期压后,将聚乙烯导管退出心室,可进一步记录动脉血压,记录大鼠标Ⅱ导联心电图,同步得到心率.然后将大鼠取俯卧位,经腹膜后暴露左肾,在手术显微镜下剥离肾交感神经,结扎远端,将神经中枢端置于双极铂丝电极上,灌入配制好的温热液体石蜡,温度为37℃,使神经与记录电极结合处于周围组织绝缘并湿润和保护神经.肾神经传出放电信号经生物电放大器放大后记录到生理记录仪上,同时对肾神经传出放电信号进行积分处理.实验结束时,钳夹神经中枢段,以此时积分值作为RSNA的噪声水平.由多道生理记录仪描记的积分值减去其噪声水平即为RSNA的积分.2.4微量注射人工瞳体gm3-4将动物俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上,参照Paxions&Waston大鼠脑图谱,在室旁核微量注射200nl相同体积的溶剂(Vehicle)人工脑脊液(pH=7.4),并先后微量注射200nlCGP35348(0.5、1、2nmol),从每次注射完成后开始计时,连续观察RSNA、AP和HR对微量注射药物或人工脑脊液的反应.微注射实验完毕,鉴定注射部位.2.5心肌面积测量上述实验完成后取出心脏,-20℃保存.心肌梗死面积测定方法详见文献.2.6gabab受体的rt-pcr检测已有研究报道,室旁核内可表达GABAB受体,而GABAB受体1a亚型是GABAB受体的主导优势亚型,故选择该亚型,通过RT-PCR的方法来检测其与GABAB受体功能的相关性.用于GABAB受体1a亚型mRNA表达量检测的引物序列(见表1).GABAB受体1a亚型mRNA表达量以与内参管家基因GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)的密度的比值表示.2.7治疗前后心率和血压的变化所有数据都用均数±标准误(x—±SE)(x—±SE)表示,RSNA对不同剂量药物的反应以在基线基础上的变化百分率表示,而心率和血压对不同剂量药物的反应则以变化值表示.各实验组之间原始数据和参数的相对改变采用二元ANOVANewmanKeuls检验进行多重比较或采用Student’st检验.P<0.05代表具有显著性差异.3结果3.1血压mis和左心室心肌损伤情况对大鼠心脏标本进行病理分析,发现心衰安静组大鼠心脏重量、体重和肺湿重与假手术安静组相比明显增加(P<0.05),结果提示心衰大鼠出现水潴留.游泳训练能明显降低心衰组大鼠体重和肺湿重.与假手术对照组相比,心衰组大鼠左心室心肌梗死面积(MIS)明显增加,心梗面积在30%～40%之间;假手术大鼠左心室心肌未见损伤.心衰组大鼠左心室最大收缩舒张速率(±dp/dt)明显低于假手术组;而心衰组大鼠左室舒张末期压(LVEDP)却明显高于假手术组;以上结果提示心衰组大鼠的心脏收缩和舒张功能减退.但是游泳训练并没有明显改变假手术组和心衰组大鼠左室舒张末期压和左心室最大收缩舒张速率.3.2大鼠室旁核内gabab受体1亚型mrna表达量假手术安静组、心衰安静组、假手术训练组和心衰训练组大鼠室旁核内GABAB受体1a亚型mRNA表达量的光强度比值分别为0.90、0.51、0.95和0.81.心衰安静组大鼠室旁核内GABAB受体1a亚型mRNA表达量与假手术安静组相比发生下调(P<0.05).游泳训练明显增加心衰训练组大鼠室旁核内GABAB受体1a亚型mRNA表达量(与心衰安静组相比,P<0.05)(见图1).3.3组大鼠心率,血压提高和肾市在假手术组和心衰组大鼠室旁核内微量注射CGP35348(0.5、1和2nmol)剂量依赖性的导致心率、血压的升高和肾交感神经放电的显著增强.各指标开始反应的时间是3～5min,峰值出现在微量注射后的6～8min内,心衰安静组大鼠心率、血压升高和肾交感神经放电的增强作用发生钝化(与假手术安静组相比)(P<0.05).游泳训练明显改善心衰训练组大鼠心率、血压升高和肾交感神经放电增强的钝化作用(与心衰安静组相比,P<0.05)(见图2).4运动训练改善心力衰竭大鼠室旁核内gabab受体表达量的机制本研究首次发现心衰组大鼠室旁核内GABAB受体mRNA表达量明显下调,这种下调作用很可能是导致心衰大鼠交感兴奋作用增强的重要机制之一.同时,也首次证明游泳训练可恢复心衰组大鼠室旁核内GABAB受体mRNA表达量,并且当使用GABAB受体阻断剂CGP35348阻断室旁核内源性GABA作用时,心衰组大鼠肾交感神经活动、心率和动脉血压增加的作用与假手术组大鼠相比发生明显的钝化.而游泳训练过后,这种钝化作用趋于正常.这些实验结果提示运动训练心衰组大鼠的交感抑制作用的增强可能与室旁核内GABAB受体的上调以及室旁核内源性GABA抑制作用的改善有关.阻断假手术安静组大鼠室旁核GABAB受体可增加动脉血压和肾交感神经放电活动,提示GABAB受体参与介导室旁核对心血管的紧张性调节活动.而LiDP等在正常血压大鼠上未发现血压及交感神经活动的增强,出现这一矛盾结果的原因可能是因为微注射溶剂的体积不同引起(本研究使用体积为200nl,而他们使用体积为50nl).50nl溶液可能无法干预到室旁核内大部分神经元,而200nl却能影响更多的神经元.运动训练运动训练上调心衰大鼠室旁核GABAB受体mRNA的表达量的确切机制仍不清楚.然而,众所周知室旁核可接收来自心迷走传入反射等不同的心肺感受器反射的信息.有研究显示运动训练可影响心迷走神经活动,如增加心率、心肌收缩力、心肌的前后负荷等血流动力学参数.另有研究报道,运动训练可增强动脉压力感受性反射对心率的调控,这一机制可能与迷走神经的紧张性增强有关.因此,运动训练时激活心迷走神经活动可能诱发室旁核内GABA