心力衰竭大鼠下丘脑室旁核内血管紧张素转换酶的变化及其对器官能量和神经活动的影响

心力衰竭大鼠下丘脑室旁核内血管紧张素转换酶的变化及其对器官能量和神经活动的影响

慢性心力衰竭（chf）被称为心力衰竭，是指周围组织器官注射减少和心率恶化的临床综合征。这是各种心血管疾病的主要并发症。探讨其发病机制和寻找有效治疗手段是目前研究的热点。交感神经活动持续增强是心衰发生发展的重要因素,是造成患者心功能恶化及猝死的主要原因。抑制交感神经过度激活是心衰治疗的关键。近年研究发现中枢调控机制的改变可以使心衰末期已经存在的交感神经活动增强、心功能下降和水钠潴留进一步恶化,对心衰的发生发展具有重要作用。室旁核是直接调控交感神经传出活动的重要中枢位点,心衰时室旁核兴奋性增加,伴有交感神经过度激活和外周肾素-血管紧张素系统(RAS)激活。脑内血管紧张素转换酶(ACE)对心血管功能和交感神经活动具有重要的调节作用。本研究将采用室旁核内持续微量注入ACE抑制剂(ACEI)的方法,探讨心衰时室旁核中ACE可能发生的改变及其对心衰发生发展和交感神经活动的影响。1材料和方法1.1药物治疗及给药情况选取健康成年雄性SD大鼠,由山西医科大学实验动物中心提供,体质量230~250g。大鼠随机分为冠状动脉结扎术诱导的心衰组(HF+PVNVEH)和假手术组(SHAM+PVNVEH)(PVN:药物均为室旁核给药。VEH:空白对照药,即人工脑脊液,0.11μl/h)。心衰组又随机给予ACE抑制剂赖诺普利治疗(Lisinopril,0.46μg/h)。每组动物12只,共36只。1.2脑图谱定位室旁核大鼠经3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后,头部固定在脑立体定位仪上,暴露颅骨,以前囟为基点,按照大鼠脑图谱定位室旁核,坐标为:AP-1.8mm,LR-0.2mm,H-7.9mm。用小钻头穿透颅骨进行插管,将带芯的外径0.5mm、内径0.2mm的不锈钢管插至室旁核,牙脱粉颅外固定。1.3呼吸前后st段室旁核插管术后1周,麻醉大鼠,经口腔气管插管机械通气。记录标准Ⅱ导联心电图。无菌条件下开胸暴露心脏。结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线不结扎)。结扎后左心室壁颜色变暗或苍白,心电图ST段有典型缺血性表现。随后逐层闭合胸腔,常规碘伏消毒。大鼠自主呼吸恢复后,拔除气管插管。术后消炎治疗3d。1.4外包的不锈钢管内芯内芯内芯内固定,内皮外接冠状动脉结扎术后,大鼠俯卧位,切开颈背部皮肤,拔除室旁核插管的内芯,将外径0.2mm的不锈钢管插入室旁核插管,并与其一同固定,再通过塑料胶管与充满药液的微型渗透泵相连,埋于颈背部皮下,缝合局部皮肤。术后大鼠分笼常规饲养,观察一般状况。1.5左室射血分数大鼠术后4周进行超声心动图检查,超声心动图检查由资深专业技师进行操作。大鼠麻醉后仰卧位固定,胸部备皮,超声心动图监测大鼠左室射血分数(LVEF)。LVEF<35%为心衰模型成功标志。1.6心力衰竭模型大鼠术后4周,超声心动图检查后,行右侧颈总动脉插管,管内充满0.25%肝素生理盐水抗凝,插管逆行进入左心室,记录心率(HR)、左心室舒张末压(LVEDP)和左心室内压力最大上升或下降速率(±dp/dtmax)等。LVEDP≥2kPa(15mmHg)为心衰模型成功标志。之后,于左侧腹侧部肋下切口,暴露腹膜后肾脏,玻璃分针分离肾交感神经,将肾交感神经浸于37℃石蜡油中,搭于一对银记录电极上,电生理记录仪记录其放电活动。1.7小鼠血清右心室大鼠开腹后腹主动脉采血,血浆留存于-80℃冰箱。同时,冰上迅速摘取心脏和肺等组织,漓干称重,分离右心室,室间隔留于右心室,称重。断头取脑,采集下丘脑标本,-80℃冰箱保存。1.9免疫组化染色实验动物麻醉后,采用2%多聚甲醛溶液经左心室-升主动脉灌注固定,留取心脏、脑等组织,后固定于2%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)中,然后放入30%蔗糖PBS脱水至组织下沉。取固定后脑组织,截取视交叉与乳头体之间部分,冰冻切片机进行冠状切片,切片厚度10μm,贴于防脱玻片,进行免疫组织化学染色。切片室温放置1h后,使用0.01mol/L的PBS液漂洗;3%H2O2甲醇液,0.2%Triton-X100PBS液37℃孵育,5%血清封闭。加入兔抗大鼠ACE的一抗(1:150)置入4℃冰箱过夜。次日PBS漂洗,加入于生物素标记的羊抗兔IgG液中(1∶100稀释)30min;PBS冲洗,再加入辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素37℃孵育30min,PBS冲洗,每张切片滴加2滴新配制的N-芴甲氧羰基-N′-苄氧羰基-L-2,4-二氨基丁酚(DAB)显色剂,室温下光镜监视其显色3~5min,显色满意后自来水冲洗终止显色;之后常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。最后进行图像分析和统计学处理:明视野显微镜下对大鼠脑切片各部免疫阳性反应逐一观察,摄片,分析。用捷达801图像分析软件,选取免疫组化标记的切片,测切片的累积光密度值(A值)。1.11统计评估所有实验数据均采用SPSS13.0软件进行统计学分析,实验数据用表示,采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1一般情况心衰组大鼠与假手术组大鼠比较,食欲较差,体质量增加缓慢,毛色晦暗无光泽,精神差,反应迟钝。2.2脉粘结线下的心肌梗死区心肌组织病理学变化术后4周,开胸肉眼观察,心衰组大鼠在冠脉结扎线下方的心肌梗死区心肌被白色菲薄的结缔组织代替,室壁变薄,左室心腔扩大,非梗死区室壁增厚;假手术组大鼠心脏无异常。2.4假手术组和假手术组大鼠的活性比较见表2。心衰组大鼠在冠脉结扎4周后,肾交感神经活性显著高于假手术组大鼠(P<0.05);心衰大鼠室旁核内给予赖诺普利治疗后肾交感神经放电活动明显下降,但是仍然高于假手术组(P<0.05)。2.5大鼠lvef的变化冠脉结扎术后4周,与假手术组比较心衰大鼠LVEF显著下降(P<0.05);心衰大鼠室旁核内给予赖诺普利治疗后LVEF略有上升,但无明显改善,见表3。2.7手术组两组患者p>0.05心衰组大鼠血浆NE和AngⅡ含量均显著高于假手术组,P<0.05;心衰大鼠室旁核内给予赖诺普利治疗后血浆NE和AngⅡ含量均显著下降,P<0.05,但仍显著高于假手术组。见表5。2.8各组大鼠阿利克氏抗体对大鼠阿利克氏体叶片累积a值的影响下丘脑室旁核内ACE免疫反应阳性染色定位于神经元胞浆内。心衰组大鼠ACE免疫反应阳性神经元切片的累积A值显著大于假手术组(P<0.05)。心衰大鼠室旁核内给予赖诺普利治疗后切片A值显著下降(P<0.05)。2.9心力衰竭大鼠室旁核内fra-在表达水平fra-比较Westernblot检测结果显示,与假手术组相比,心衰组大鼠室旁核内Fra-like蛋白含量明显升高,P<0.05;心衰大鼠室旁核内给予赖诺普利治疗后Fralike蛋白含量明显下降,P<0.05。3特殊类型心脏病患者室旁核和肾素-血管紧张素系统ras的表达情况慢性充血性心力衰竭是以周围组织脏器灌注减少、心功能进行性恶化为表现的一种临床综合征,是冠心病、高血压等多种心血管疾病的主要并发症。心衰的病理机制极其复杂,探讨其发病机制和寻找有效治疗手段是目前研究的热点。交感神经活动持续增强是心衰发生发展的重要原因,可以促进心衰的恶化。因此降低交感神经的兴奋性成为研究的焦点。临床治疗中常规使用β-肾上腺素能受体阻滞剂对抗心衰时增加了的交感神经活性,可以明显改善心衰患者的预后,但是并不能完全消除心衰时交感神经过度激活的状态。研究发现中枢神经体液机制的改变会使心衰时存在的水钠潴留,交感神经激活和心功能下降进一步恶化。大量基础和临床证据表明,心梗后心衰患者心脏性猝死的发生的部分原因是由中枢神经系统活动的改变所介导,其中交感神经中枢的激活是心衰等心血管疾病病理机制的重要因素。下丘脑室旁核是中枢神经系统调控交感紧张性活动最主要的中枢位点,通过增加交感神经放电和释放抗利尿激素而发挥它在心血管活动调节中的关键作用。核团内神经体液因子发生改变会明显影响外周交感神经的放电活动。刺激正常大鼠室旁核不仅导致大鼠血压升高、肾交感神经放电活动增强,还可以引起心肌收缩力增强,心率增快,心肌耗氧量增加,对心血管功能的调节具有重要作用。而心衰时室旁核神经元兴奋性增加是心衰发生发展的重要因素。针对室旁核等心血管中枢在心衰机制中的重要作用,许多学者把室旁核作为心力衰竭药物治疗的新靶点正在进行一系列科学试验,证实心衰时脑内神经内分泌机制的改变可能是诱发心衰时交感神经传出增加的重要因素,因此将中枢神经激素的激活与外周交感神经活动增强联系起来。肾素-血管紧张素系统(RAS)是人体重要的体液调节系统,主要通过AngⅡ与血管紧张素1型受体(AT1-R)结合发挥作用。心衰时外周RAS被激活,血浆AngⅡ增加,促进血管收缩、水钠潴留,心室重构并且出现持续的交感神经活动加强,最终导致心功能不断减退。目前对于心衰时脑内RAS是如何促进交感神经活动的确切机制还不清楚。Francis等研究证实,将脑内血管紧张素原缺陷的转基因大鼠经冠脉结扎制作成心衰模型后,交感神经激活及心室重构现象都较SD心衰大鼠明显减轻,提示心衰时脑内RAS可能参与了心衰的发生发展。在脑内RAS各成分均有表达。并且脑内产生的AngⅡ具有升高血压,促进精氨酸加压素释放,兴奋交感神经中枢,促进交感神经激活等功能。ACE广泛分布于中枢神经系统各个脑区。主要通过调节AngⅡ的产生发挥其生理功能。中枢ACE的活性对维持正常大鼠肾交感神经的基础紧张性放电具有重要作用,正常时室周器尤其是穹窿下器、终板血管器、延髓的极后区和正中隆起均存在高浓度的ACE。心衰时室周器存在的大量的ACE被激活,使外周血液中的AngⅠ到达室周器时在此处经ACE作用使脑内同样可以产生大量的AngⅡ,最终发挥其心血管功能的调节作用。此外免疫组织化学研究证实,在室旁核、孤束核和延髓头端腹外侧区等自主神经中枢均有ACE的表达,特别是在室旁核区域不仅有RAS各成分的表达,还有含量最为丰富的ACE、AngⅡ和AT1-R的存在。室旁核中ACE的蛋白质和mRNA表达增加时,可以通过促进室旁核AngⅡ产生,使交感神经的活动增强。在临床工作中,患者长期使用ACEI已经成为心衰治疗的首选药物和常规治疗,可以明显改善患者的临床症状、减少住院率及病死率,并且对于轻、中及重度心衰患者均有效。而研究发现经冠状动脉结扎术诱导的心衰大鼠,经口服或脑室给予ACEI都可以减少脑内ANGⅡ的产生,减少或阻止心衰时增加了的交感神经放电。此外,研究还证实长期侧脑室给予ACEI治疗心衰,不仅可以使室旁核区域ACE和AT1-R表达下降,降低交感神经活动,并且可以使心衰时水钠潴留、左室舒张末期容积及左室重构均明显减轻。本研究证实,经冠状动脉结扎术诱导的心衰大鼠心功能明显下降的同时,下丘脑室旁核神经元兴奋性增加,室旁核内ACE表达增多,外周交感神经活动增强。而室旁核内长期持续微量注入赖诺普利一方面可以明显改善心衰大鼠的心功能,使外周交感神经活动减弱,还可以使室旁核内表达增多的ACE减少,说明室旁核ACE表达增多、活性增强使室旁核兴奋性增加,与心衰时交感神经的过度激活有关,对心血管功能具有重要的调节作用。心衰时室旁核内部RAS激活是心衰时交感神经激活和心功能恶化的重要因素。但是目前对于RAS的中枢阻断药物的研制还未全面开展,但以上动物实验已经证明中枢内使用ACEI无论是对心衰时水钠潴留、交感神经兴奋还是心室重构和心功能的改善,其效果都很明显。说明中枢RAS在心衰发生发展中的作用十分重要,神经内分泌机制将心衰时交感神经在其发病中的作用与中枢神经系统联系起来,因此非常有必要对其中枢机制进行更深入的探索。1.8大鼠血浆中ang和去甲肾上腺素的含量检测取各实验组大鼠血浆。严格按照ELISA试剂盒说明步骤操作,检测各实验组大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和去甲肾上腺素(NE)的含量。最后通过酶标仪读取结果。1.10pvdf膜的制备提取脑组织样品蛋白,确定上样量,100℃加热使蛋白质变性。使用10%分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%小牛血清封闭、加入TBST稀释的兔抗大鼠Fra-like(1∶200),4℃过夜,使抗原抗体充分结合。再加入HRP标记的羊抗兔IgG,37℃条件下孵育2h。最后加入化学发光底物,显影定影,X线底片曝光记录。曝光后在PVDF膜还未干燥前用100mmol/L巯基乙醇,2%SDS,62.5mmol/LTris-HCl,pH6.7的缓冲液室温下漂洗PVDF膜,随后加入β-Actin一抗(1∶1000)按上述步骤检测内参Actin的表达情况。之后进行图像分析和统计学处理,所拍胶片用KodakDigitalScience1D软件分别计算Fra-like和β-actin各曝光条带的面积和灰度的乘积,并计算出Fra-like对应曝光条带所得乘积与β-actin条带所得乘积的比值。2.3左心室内给予赖诺菲尔德干预后lvedp的变化见表1。心衰组大鼠左