蛋白质组学研究现状与展望

蛋白质组学研究现状与展望

蛋白质组的概念由澳大利亚科学家wilkin和威廉姆斯在1994年提出，并在1995年7月首次发表。它指的是由同一个矩阵、细胞、组织或生物表达的所有蛋白质。蛋白质组学(Proteomics)是以细胞或组织不同时间、环境的所有蛋白质为研究对象,从整体上研究蛋白质的种类、相互作用以及功能结构的一门科学,其强调蛋白质类型与数量在不同种类、不同时间和条件下的动态本质,从而在细胞和生命有机体的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。这种思路与中医认识疾病的整体观念具有趋同性,可谓不谋而合。蛋白质组学技术主要是指利用双向电泳进行蛋白质分离,再用计算机软件进行图像分析,然后通过质谱分析技术及蛋白质数据库信息对目的蛋白进行分析和鉴定的方法。随着蛋白质组学技术的不断发展,已被广泛应用到生命科学的各个领域。不同因素作用于人体,引起从遗传信息到整体功能实现中的分子、细胞、器官、整体多个层面的结构与功能状态的改变,调节这些层面的结构与功能的本质是基因,而直接的作用者主要是蛋白质。因此,以蛋白质表达为指标,以蛋白质调控改变和功能修饰为研究对象,进行中医药研究也是可行的。近年来,蛋白质组学技术被逐渐应用到中医药研究领域,并取得了一定成果。主要在以下几个方面:1高血压肝阳上保持组织生长的大鼠一般资料的表达证候是疾病发展过程中某一阶段的病机概括,是机体内因和环境外因综合作用的机体反应状态,并随着病程的发展而变化。这些反应变化只有在表达为相应的蛋白质后才能最终影响生物功能。进行不同中医证候产生前后蛋白质组学研究,探究中医证候产生的物质基础支配机制,揭示中医证候的科学内涵,能够为中医诊断的客观化提供依据和方法。肝阳上亢证是常见中医证型之一,多见于原发性高血压、甲亢、中风等病。李臻琰等采用自发性高血压大鼠加灌附子汤复制高血压肝阳上亢证大鼠模型,造模成功后自发性高血压大鼠出现肝阳上亢证候表现;用固相pH梯度双向凝胶电泳分离各组大鼠下丘脑的总蛋白质,经考马斯亮兰染色,PDQuest7.0软件分析;与正常组比较,肝阳上亢证组中蛋白质点表达上升2倍及以上的点有26个,下降2倍及以上的点有97个,这些下丘脑的表达差异蛋白可能与高血压肝阳上亢证有关。张娴等建立并分析正常、高血压肝阳上亢模型大鼠脾单个核细胞蛋白图谱和正常人、原发性高血压肝阳上亢患者外周血单个核细胞的蛋白图谱,与正常组比较,发现高血压肝阳上亢大鼠组独有点387个,而高血压肝阳上亢患者组独有点515个,这为进一步进行蛋白质鉴定,探讨高血压肝阳上亢证的分子机制提供了实验基础。目前,还利用蛋白质组学对肾阳虚证、血瘀证、血虚证、肝郁证、慢性胃炎湿证等证的本质进行了研究。笔者认为从动物和人体两个方面,通过对不同疾病的同一证型(异病同证)和同一疾病的不同证型(同病异证)的蛋白质组学研究,逐步完善从而全面展示证候的科学内涵,探寻病证的诊断性蛋白,为诊断的客观化提供确实的科学依据是可行的。2酰胺凝胶蛋白电泳检测针刺肌肉中的分子质量针灸以其独特的方法和临床有效性正在被越来越多的国家和地区所接受并推广应用开来。针灸具有双向调节作用,其调节作用可通过多途径实现,如神经-内分泌-免疫网络等,表明了针灸效应的客观性。以针灸临床有效性为基础的针灸作用原理研究,引出了针灸效应物质基础的深层次问题,蛋白质组学技术则有可能成为打开这扇门的一把钥匙。王静等采用变性聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳方法,对多种针刺位点的大鼠胃经和任脉沿线(循经)脂肪条带结构匀浆上清液进行变性蛋白电泳,并对电泳图谱条带识别比对分析,发现针刺大鼠胃经和任脉线上的腧穴和非穴点,其相应沿线脂肪条带结构匀浆蛋白电泳表现出相同的差异性条带,故认为表达差异的蛋白是针刺产生的经络效应的物质基础。石学敏等[12、13]采用优化的双向电泳技术条件建立了高质量的、稳定的、高度重复性的大鼠脑皮质、海马蛋白质组双向电泳图谱,并以基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定了84个蛋白,初步建立了大鼠脑皮质、海马蛋白质组数据库;并构建了局灶性脑缺血模型大鼠脑皮质蛋白质组差异表达图谱;同时发现了针刺治疗的部分效应蛋白,包括热休克蛋白及分子伴侣、抗氧化蛋白、结构蛋白、信号蛋白、炎症反应蛋白、生长因子、神经元特异蛋白等;早期介入“醒脑开窍”针刺对脑梗死超早期、急性期患者血浆神经肽Y(NPY)、降钙素基因相关肽(CGRP)也具有良性调整作用。这些进一步揭示了“醒脑开窍”针刺的脑保护作用及抗损伤修复机制,其治疗脑缺血性卒中是通过多途径、多靶点、多层次的整体调整作用的结果。3抗炎活性成分的筛选目前用传统方法进行中药研究,在取得积极进展和大量成果的同时,也发现存在许多问题,如提取和纯化程度越高,疗效越不理想;对中药的作用机制仍然处于初步认识阶段,多数停留在药效观察水平。蛋白质组学技术的应用,使我们能通过对用药前后组织或细胞的差异蛋白质组展示来评价中药的药效,而且可以针对其中特异表达或差异表达显著的蛋白点进行更深一步的后续质谱鉴定研究,确定药物作用的靶蛋白,这种全景式分析研究方法必将大大加速中药活性筛选过程。张萃等通过内毒素诱导的炎症细胞模型,从丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、盐酸川芎嗪、阿魏酸、姜黄素、莪术油中筛选抗炎活血化瘀中药单体,发现丹参酮ⅡA对内毒素诱导的炎症细胞模型有明显抑制作用,双向电泳图象分析筛选出差异性明显的蛋白质点26个。模型组有16个蛋白点增高,丹参酮ⅡA能使其中的13个蛋白点下调(占50%),3个进一步上调(占11.5%);而对模型组表达下调的10个蛋白点,丹参酮ⅡA对其均有不同程度上调趋势。故内毒素感染的细胞模型适合实验室小剂量中药单体的筛选,丹参酮ⅡA的抗炎作用与这些差异表达蛋白质有关,能够调节一些蛋白质的表达。若进一步开展蛋白质鉴定分析,则有可能发现靶点蛋白,从而为筛选中药单体活性物质提供支持。4马中心虾养殖大鼠肾组织中蛋白表达差异中药毒性的研究备受世人瞩目,建立符合国际标准的中药安全性评价体系,已成为亟待解决的重大课题。现阶段中药毒性研究主要集中在组织形态学的改变及生化指标检测,而缺乏深入的机理研究。运用中医的思维方式,结合蛋白质组学技术,开展中药毒性研究,揭示中药产生毒性作用的机制,找出其关键环节和作用靶点,予以干预,可达到减轻其毒性作用的目的。孙世仁等应用马兜铃酸腹腔注射制备大鼠慢性马兜铃酸肾病模型,提取其肾组织中总蛋白质,采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对模型组和正常组肾组织中蛋白质进行差异展示,建立了模型组和正常组大鼠肾组织的双向电泳图谱,发现了差异蛋白质,并认为这些蛋白质可能介导了马兜铃酸的毒性作用;同时发现12周时马兜铃酸诱导肾间质开始出现纤维化(早期),并进一步对马兜铃酸诱导肾间质纤维化早期(12周)大鼠模型的肾组织和正常大鼠肾组织进行蛋白差异展示,并用分析软件进行分析,结果显示双向电泳图谱的匹配率可达83.4%,同时可见一些明显差异的蛋白质点,提示这些差异表达的蛋白质可能参与马兜铃酸致肾损害早期过程的毒性作用,可能成为马兜铃酸导致肾纤维化的始动分子。一旦确定,这将使早期诊断和早期治疗(在蛋白质或基因水平进行干预和阻断)成为可能。5对云南紫草宁的应用研究中药资源稀缺的问题虽然通过人工栽培的方式得到了缓解,但仍未得到解决。而且药材中有效成分往往含量甚微,通过功能基因组和蛋白质组研究,可以对生物体中影响有效或毒性成分合成的关键基因进行调控,促进其表达,提高目标产物的产量,降低毒性成分和非有效成分含量,甚而实现单独生产有效成分等等,基于此进行的品种改良和细胞培养工程将会为解决中药资源短缺问题提供帮助,同时也可提高中药的安全性。张文举等应用差异蛋白质组学技术研究了不同光信号下滇紫草培养细胞的蛋白质差异表达谱,通过ImageMaster2DElite5.0软件包进行蛋白点的检测、配比和差异分析,发现90个差异蛋白质点,经MALDI-TOF-MS鉴定,与蛋白质数据库中已鉴定的蛋白质进行匹配分析表明,发现一些在数据库中无匹配蛋白的差异蛋白质点,并认为其中可能包括一些重要的与紫草宁次生代谢调控相关的新蛋白,在未来的研究中运用串联质谱等技术做进一步的结构和功能分析,将会为深入揭示光信号调控的紫草宁合成的分子机制提供更多的依据。向秋等[18则采用双向电泳(2-DE)技术构建不同时期罗汉果蛋白质组图谱,应用ImageMaster2D图像分析软件进行分析,并认为罗汉果生长、发育和成熟的不同阶段受特定基因的表达调控,为罗汉果的开发和品种改良开辟了新方向。6蛋白质组在中医药中的应用由于宏观上中药作用靶点和作用机制的多样性及对基因作用的多样性,中药蛋白质组学指纹图谱,可在分子水平上丰富整个中药指纹图谱研究体系。中药蛋白质组学指纹图谱除了能够较全面地提供中药材及中药制剂的复杂物质基础的大量信息,同时还能提供量效相关信息,起到鉴定和研发的双重作用,比较不同蛋白质指纹图谱体现的不同药效结果,就可确定该制剂的最佳成分配伍,这对于中成药的二次开发和中药新药的研制有显著的意义。Lum等利用2-DE研究了西洋参主根、人参不同取材部位(主根、侧根、芦头、表皮)以及组织培养野生人参细胞的蛋白质表达谱,结果显示不同参样本的2-DE图谱(指纹谱)显著不同,能够轻易地分辨开来,而传统的基于色谱和分析鉴定技术却达不到这一效果。李春梅等应用激光解析/离子化-飞行时间质谱技术(SELDI-TOFMS)对传统中药龟甲胶、阿胶蛋白/肽成分进行蛋白质组初步分析,分别获得的有意义蛋白/肽共计6、9个。通过分析建立龟甲胶、阿胶蛋白质/肽成分质量指纹图,可作为龟甲胶、阿胶数字化质控标准;并为进一步分离、纯化及验证龟甲胶、阿胶功能相关活性蛋白质/肽成分提供可靠信息。综上所述,目前将蛋白质组引入到中医药领域的研究很多,也取得了一定的成果,但仍存在一些问题,主要有:(1)大部分研究停留在对蛋白质组表达差异现象的描述上,仅局限于极少部分细胞和组织,对差异蛋白所具有的生物学意义以及它们之间的相互联系和作用研究很少,对靶点的探索研究也很少。(2)偏重于对中药作用机制的研究,而对中医基础理论的几个关键问题,如证本质的研究、脏象理论等方面的研究较少。(3)虽然证本质的研究有所涉及,但缺乏广泛的异病同证和同病异证的研究,而这两方面研究的结合对更完整地揭示中医证候的本质恰恰是很重要的。(4)