蛋白质组学技术的研究进展

蛋白质组学技术的研究进展

蛋白质组的概念由澳大利亚的科学家马克韦尔和威廉提出，并于1994年首次在elckshichorphones发表。现在把它定义为“基因组表达的全部蛋白质,它与基因组相对应,也是一个整体的概念”。蛋白质组学(proteomics)则是以蛋白质组为研究对象,从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的一门科学。近年来,由于蛋白组学研究方法以及技术的不断改进和提高,使得蛋白组学的研究取得了迅猛的发展。本文对近年来蛋白组学技术的进展及其在中医药领域的应用作一综述。1蛋白组技术的进展1.1显微解剖相关研究进展样品制备是蛋白质研究的首要步骤,目的是尽可能去除样品中非蛋白物质,最大可能地提取全部蛋白质。由于临床上所取的样品都不是由相同的实体组成,它们有着各自不同的物理和化学特性,因此,能否解决细胞的异质性问题,将对病变细胞的蛋白质组分析起着关键的作用。目前常用的样品处理技术有液相等电聚焦、膜电泳、吸附色谱、亚细胞分级、激光捕获显微解剖技术(lasercapturemicrodissection,LCM)、非电荷还原剂及酶抑制剂的使用、连续多步提取方法、变形剂及表面活性剂。LCM是一种快速可靠的组织细胞分离方法,该技术能在复杂的环境中挑选出需要的细胞团,用于提取高质量的DNA、RNA和蛋白质,从而较好地解决了组织细胞异质性问题。因此,其特别适用于肿瘤学方面的研究。但其分离能力有限,而且由于该法处理样品所需时间较长,对于低拷贝蛋白检测效率略低,因此,在一定程度上限制了其在临床快速诊断中的应用。近年来,基于氮激光的微束切割-激光压力弹送法技术(lasermicrobeammicrodissection-laserpressurecatapultting,LMM-LPC)和质谱成像(imagingMS)等技术正在快速应用于许多领域,包括肿瘤研究。1.2蛋白质分离技术1.2.1蛋白质电泳技术1.2.1.凝胶电泳检测蛋白质2DE的引进,奠定了平行蛋白质分析的技术基础,并已成为蛋白质组学研究中最为常用的蛋白质分离技术,也是目前惟一能将数千种蛋白质同时进行分离与展示的分离技术,但该技术的重复性、敏感性较差,缺乏对蛋白质点的精确定量,对一些小分子量的蛋白质也无能为力。近年来发展起来的荧光差异双向凝胶电泳(fluorescenttwo-dimensionaldifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE)克服了以上缺点,能精确地在较宽的动态范围内对相应的蛋白质进行定量,而且引进内标,使凝胶内的待比较样品对应于内标产生了标准化的数据,可检测到样品间小于10%的蛋白质表达差异,统计学可信度达到95%以上。孙成荣等应用2D-DIGE对一对来源于同一亲本细胞,且淋巴道转移潜能显著不同的小鼠肝癌腹水细胞株(Hca-F和Hca-P)的基因表达进行比较研究,发现Hca-F和Hca-P细胞之间163个有统计学差异的蛋白质点,选取2倍以上的23个蛋白质点进行质谱分析,共鉴定出17个可能与肝癌淋巴道转移相关的蛋白质,这些蛋白质都能在人类组织细胞中找到同源蛋白。1.2.1.等电聚合酶ph梯度双向电泳该技术是用固相pH梯度干胶条代替两性电解质,加上与干胶条相配套的电泳仪进行第一向等电聚焦,提高了电泳分辨率和结果的重复性,尤其是不同实验室之间结果的可比性。固相pH梯度双向电泳体系已成为蛋白质组研究中分析复杂蛋白质复合物的基本工具。但该技术对疏水性强、强酸强碱性以及具有重要功能的低丰度蛋白质无法检测,因而限制其应用。1.2.1.电泳分离技术该技术又称为高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE),是经典电泳技术与现代柱式分离技术的结合,主要包括毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦和筛板SDS-毛细管电泳等。该技术弥补了传统双向凝胶电泳无法实现的高效、快速自动化分析,灵敏度可达10-19mol。CE/MS联用还可用于研究差异表达蛋白的具体功能结构,对单一纯品尤为适用,而对复杂样品的分离尚不完全。此外,由于管径太过纤细,特大分子蛋白质易受阻。该法目前仍不能在研究中被广泛应用,需进一步对该技术的应用进行探索。1.2.2与质谱相结合的应用双向高效液相色谱技术(2D-HPLC)是一种很好的蛋白质分离技术。其分离蛋白质的容量比2-DE大,且操作简单、速度快。通过与质谱结合,其既可在常温下分离制备水溶性物质,又具有高温、高效、高分辨率和高灵敏度等特点,可用于很多不易挥发、难以热分解物质的全自动定性、定量分析,因此实际工作中常用于膜蛋白及低丰度蛋白质的分离鉴定。不足之处在于其较难实现对细胞、组织全部蛋白质的识别与鉴定。相信随着对其方法的不断改进,多维HPLC将成为大规模蛋白质分离与鉴定方法之一。1.3蛋白质的检测样品分离后,通过计算机图象软件分析,可以找到蛋白质表达的差异点,然后进行切割酶解,进而进行分析鉴定,确定其种类、组成和修饰,再搜索蛋白质数据库进行对比以进一步确定蛋白质的信息。1.3.1质量分析技术1.3.1.其他普通成分检测指标即蛋白质指纹图谱技术,是目前蛋白质组学研究中比较理想的技术平台。SELDI技术是一种包含层析与质谱的特殊蛋白质芯片技术,综合了芯片微阵列与质谱技术两者的优点,具有快速、操作简便、样品用量少、灵敏度高以及对多样品的平行检测等特征,可以直接检测未经处理的样品,如血液、尿液、关节腔液等,还可分析疏水蛋白质特别是膜蛋白质、pI值过高或过低的蛋白质以及低分子量的蛋白质等,适合大规模筛选疾病相关生物标志物以及对肿瘤的早期检测和风险评估都有潜在的应用前景[22~24]。若将正常人样本的图谱信息同某种疾病患者比较就有望发现新的疾病相关蛋白质。Ali等通过SELDI-TOF-MS技术研究发现荷质比为7558.9Da和15103.0Da蛋白质筛选早期肺癌患者及高危人群具有较高的特异性及敏感性。但在使用过程也发现一些问题,如图谱的峰高和蛋白质浓度之间的关系并非都是线性的,检测过程中诸多因素控制不一等。1.3.1.超微量分析技术ESI-MS常用于鉴定复杂肽混合物(如混合蛋白溶液酶切产物或SDS胶上混合蛋白质条带鉴定),由于其常具有串联质谱功能,因此得到的鉴定结果更为可靠。ESI联合nano探针注射和(或)高效毛细管液相色谱分离技术(CLC-ESI-MS)可获得极低微量的肽的序列信息,可实现蛋白质组中蛋白质成分的超微量分析。四极杆飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)技术,对蛋白质微测序和氨基酸残基的修饰分析有着重要的研究价值,其较单极四极质谱仪或离子阱质谱仪有更宽的质量范围和更高的质量准确度。而混合型的四极杆飞行时间质谱仪称之为Q-TOF或QqTOF,其质量准确度优于5ppm,应用nanoESI-MS/MS(纳电喷雾质谱技术)时,灵敏度可低达fmol水平。Carvalho等用ESI-MS及SELDI-TOF-MS技术研究了30例Hodgkin’s患者与正常人血清,发现了8个有意义的蛋白质峰,其中4个含量上调,4个含量下调,提出此方法可以作为Hodgkin’s早期诊断的依据。但该质谱技术不宜进行N-端和C-端序列鉴定,要完全鉴定某蛋白质尚需结合传统的鉴定技术如氨基酸微测序(Edman降解法)、氨基酸组成分析等以了解N-端和c-端序列信息。1.3.1.maldi-tof-ms肽质量指纹图谱分析MALDI利用激光脉冲从干燥结晶的基质中气化被分析物并使之带电,由于多肽离子带单一电荷,所以蛋白质飞行时间的长短仅与质荷比成反比。最终,探测器得到的蛋白质质荷比可同数据库进行比较,以鉴定该蛋白质。MALDI-TOF-MS普遍用于肽质量指纹图谱分析,此法方便、快速(分析时间为3~5分钟)、灵敏(可达fmol水平),肽质量检测可准确到50ppm,是目前蛋白质组研究中最常用的胶上蛋白质鉴定技术。但是,MALDI技术不能完成蛋白水解液中肽的测序,除非在分析前将肽衍生化。McCaw等采用MALDI技术研究了11例有B细胞淋巴瘤犬的淋巴结和13例正常犬的淋巴结,共发现了93个有意义的蛋白质峰,其中几个异常表达的蛋白质分别出现上调及下调,从而认为这些蛋白也许可以作为淋巴瘤的早期诊断标志。1.3.2串联质谱技术ICAT技术目前已成为蛋白质组研究技术中的核心技术之一。它是在质谱技术的基础上发展起来的一种定量质谱法,能够精确地分析不同样品中蛋白质表达量的差异,从而使蛋白质组学真正成为一种差异显示技术。此技术是用具有不同质量的小分子试剂ICAT去标记处于不同状态下的细胞中的蛋白质,再利用串联质谱技术,能非常准确地比较出两份样品中蛋白质表达水平的不同。此法可以对混合样品直接测试;能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质,尤其是疏水性蛋白等;还可以快速找出疾病相关蛋白质及生物标志分子,故可用于快速临床诊断,具有巨大应用价值。Jennifer等采用该技术比较顺铂敏感细胞系(IGOV-1)和顺铂耐药细胞系(IGOV-1/CP),发现IGOV-1/CP中细胞识别分子、S100蛋白家族成员、结合黏附分子和ATP结合蛋白异常表达增高,IGOV-1中肝细胞胞生长因子抑制剂1B和程序化细胞死亡蛋白6异常表达增高。ICAT技术的缺点是只能对含半胱氨酸残基的蛋白质进行分析,而不能测定其它的蛋白质和多肽,而且样品从处理到最后的质谱分析所经过的步骤较多,对精确的定量分析有影响。1.3.3氨基酸的组份特征此法可提供蛋白质一级结构信息,根据不同蛋白质具有特定的氨基酸组份的特征来鉴定蛋白质。该法经济,但速度较慢、灵敏度低,所需蛋白质或肽的量较大,酸性水解不彻底或部分降解时可产生氨基酸变异。1.4蛋白质组学研究蛋白质组生物信息学主要涉及蛋白质组研究结果的公布、查询及应用等,是蛋白质组学研究中不可缺少的一部分。将差异蛋白质位点进行鉴定,可分析已知蛋白质的结构、性质、功能,亦可丰富现有蛋白质数据库,进而展开功能蛋白质组学的研究。2领域的创新创造近年来,中医学从经验医学向现代医学转变,是医学科学领域的一大创新。蛋白质组学和中医认识疾病的整体观有一定的趋同性,利用其理论与方法探索中医学证候本质以及中药药效的机制都可能成为中医药理论研究的突破口。2.1中医证候学研究蛋白质组的动态变化能体现机体的动态演变,证候宏观层次上的微观辨证,是整体观的重要发展和深化。运用蛋白质组学技术,通过对同一疾病不同证候或同一证候不同疾病的蛋白质组表达差异和功能的研究,结合生物信息学和统计学比较分析,就可以建立疾病证型相关的蛋白质表达图谱和数据库。通过对中医证候产生前后蛋白质组学的研究来探索中医证型产生的物质基础并了解其变化规律,研究证候与蛋白质组学之间的关系,建立“证候—蛋白质表达谱”,以此来揭示中医证候的科学内涵,进而为中医辨证的客观化提供依据和方法。有学者对证候的蛋白质组基础开展了初步的实验研究。卢德赵等应用凝胶内差异显示电泳技术研究肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组,并从肝线粒体蛋白质组角度阐述肾阳虚与能量代谢的关系。结果表明肾阳虚动物能量代谢相关酶的变化与肾阳虚的临床虚寒症状有关。吴红金等应用蛋白质组技术观察了冠心病血瘀证病人与正常人血浆中的蛋白质变化,发现冠心病血瘀证病人血浆与正常人相比有3个蛋白质下调和6个蛋白质上调,并提出纤维蛋白原端粒酶有望作为诊断冠心病血瘀证的标志物。2.2对中药复方作用机制的探讨中药成分复杂,复方更是如此,都是一个复杂的化学成分库。因此,通过蛋白组学技术和策略,以蛋白质为靶点,分析复方及各种搭配拆分后所表达的蛋白质组的差异、鉴定其中发生相应变化的蛋白质,并通过对治则、治法理论实质的探讨,有可能对中药复方的作用机制取得突破性进展,从而极大地促进我国中医药领域生物工程制药的发展,加速中药现代化的进程。吴伟康等探讨了四逆汤保护缺血心肌的相关蛋白改变谱,发现四逆汤可以影响大鼠缺血心肌的多个蛋白质点的表达,经质谱鉴定,这些差异表达的蛋白与心肌的能量代谢、信号转导、机能、心肌细胞修复和抗氧