中医药蛋白质组学研究现状与思考

中医药蛋白质组学研究现状与思考

随着人类科学研究项目的实施，计算机科学的发展进入了后基因组制的时代。在这个时代,生命科学的主要研究对象是功能基因组学,即蛋白质组学研究。中医中药研究也应关注生命科学进展,既要利用现代生物技术阐释自身科学本质,使之更为世界所接受,也要发挥自身固有的特点优势,在不断深入的研究中为生命科学发展作出重要贡献。目前中医药蛋白质组学研究,已取得了积极的成果,但依然存在诸多问题。现对近年来有关中医药蛋白质组学的研究现状予以评析,重点在于发现问题,并提出相应的对策,以共同促进中医药发展之现代化。1蛋白质组学研究概述蛋白质是机体生物功能的最终执行分子,但传统对单个蛋白质的研究方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为:生命现象的发生往往是多因素的,必然涉及到多个蛋白质;多个蛋白质的参与是交织网络的,或平行发生,或呈级联因果;执行生理功能时的蛋白质表现是多样的、动态的。因此,要对生命的复杂活动有全面和深入的认识,必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。蛋白质组学,即以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究内容,是生命科学进入后基因组时代的重要里程碑。科学杂志《Science》把蛋白质组学列六大研究热点之一,其“热度”仅次于干细胞研究,《Nature》杂志的系列综述文章更是把蛋白质组研究推向了令人瞩目的程度。近年来蛋白质组学研究已深入到生命科学各种领域,如细胞生物学、神经生物学等,涉及各种重要的生物学现象,如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等。在癌症研究方面,蛋白质组学也成为寻找肿瘤分子标记和药物靶标最有效的方法之一,对于评价治疗疗效、对于抗肿瘤药物筛选、对于病因机制探讨、对于肿瘤亚型分级等,都具有重要价值。2蛋白质组学对传统中医药的整体、动态、网络、内在功能的把握中医药研究一直在谋求现代化发展,谋求为现代医学所阐释并走向世界。在人类基因组计划完成之前,对中医中药理论的研究也只能局限于进行单个的基因或蛋白质分析。很显然,这种对单个分子的研究选择具有一定的随机性和盲目性。而且,对单个分子的研究,很难反映中医学“整体观念”和中药作用“整体调节”的最基本特征。人类后基因组特别是蛋白质组学时代的到来,为中医药现代化发展带来新的契机。蛋白质组学之“整体、动态、网络”的特点,与中医理论“整体观念”、“辨证论治”和中药作用“整体调节”和“多层次、多靶点”等思想不谋而合!如此,蛋白质组学与传统中医药在研究生命科学的思维方法上趋于一致,也说明了在探讨复杂生命现象时,中西医两种医学相结合的必然性和重要性。利用功能蛋白质组技术和策略,分析中医证候及经中药处理过的组织、细胞或体液表达的蛋白质组,并比较处理前后蛋白质组的表达差异、蛋白质功能结构及相互作用的变化,系统地对证候本质和中药的多环节、多靶点调整作用机理进行研究,最终揭示证候的物质基础和中药作用和配伍规律。所以,蛋白质组学研究,不仅探讨中医药理论的科学本质,也为中医药科研提供了可行的实验方法。蛋白质组学的出现,为中医药学与现代医学的对话和对接提供了良好的基础。3目前，关于中医水质群的研究目前中医药蛋白质组学研究,主要集中于中医证候和中药药理研究。中医针刺蛋白质组学研究也始见报道,但仅限于个别文献,本文不予评述。3.1高血压大鼠肝脏病理组织病理学检测证候是疾病发展过程中某一阶段的病机概括,其实质是特定的蛋白质(组)执行特定的生物学功能。进行不同中医证候的蛋白质组学研究,就是探究证候产生的物质基础,揭示证候的科学内涵,并为中医诊断的客观化提供依据和方法。文献检索结果显示,目前蛋白质组学研究已涉及湿证、肾阳虚、肾阴虚、肝郁证、脾虚证、血虚证、肝阳上亢证、气滞血瘀证、热毒血瘀证。实验报道择例如下:钟小兰等以束缚制动法制备肝郁证大鼠模型,并对大鼠肝脏组织总蛋白行凝胶电泳分离,分析模型组和对照组蛋白质分子的差异表达,并经质谱分析,鉴定了3个与肝郁证相关的差异表达蛋白。李臻琰等采用自发性高血压大鼠加灌附子汤,复制高血压肝阳上亢证模型,并用双向凝胶电泳分离大鼠下丘脑的总蛋白质,经与正常组比较分析,发现模型组蛋白质点26个表达上调,97个表达下调,推测该差异蛋白点与高血压肝阳上亢证有关。此外,卢德赵等研究肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组,阐述肾阳虚与能量代谢的关系。赵慧辉等对冠心病血瘀证行蛋白质组学研究,发现在患者血浆中,α1-酸性糖蛋白等表达升高,载脂蛋白AⅣ等表达降低,并预测该差异蛋白可能作为冠心病血瘀证诊断或治疗的新靶标。3.2其他中药研究单味中药或复方的药效和药理研究,是中药作用研究的核心。利用蛋白质组学技术研究治疗前后的蛋白质谱变化,在整体水平上评价中药药效,揭示中药的作用靶点、作用环节和作用过程,力求阐明中药多靶点、多层次作用的分子机理。文献检索结果显示,目前蛋白质组学研究主要涉及中药复方,多属于经典名方,如镇肝熄风汤、四君子汤、补阳还五汤、血府逐瘀汤、桂枝汤、茵陈五苓散,也涉及少数经验方,如复方丹参片、健胃愈疡颗粒、益气解毒颗粒等。单味中药研究有泽泻、赤芍、天花粉、党参、玄参、龟版胶,以及猫爪草提取物、山茱萸提取物,中药单体研究有丹参酮、肉桂酸、马兜铃酸、去甲斑蝥素。实验报道择例如下:苗兰等研究血府逐瘀汤对气滞血瘀证模型大鼠血清蛋白质组表达的影响,经双向电泳分离血清总蛋白,并行图像分析比较,发现血府逐瘀汤可影响7个蛋白点差异表达,分析可能与其作用机理有关。申定珠等采用双向凝胶电泳分离健胃愈疡颗粒处理组和未处理组大鼠胃组织的总蛋白,结合图像分析、质谱鉴定和数据库搜索,发现处理组有12个蛋白质点表达变化,且大多数蛋白与溃疡复发的形成、生长、凋亡及免疫等相关。谢文光等利用双向电泳技术,研究赤芍治疗对大鼠热毒血瘀证的血清蛋白质组变化,结果发现,调节xPrl、xPr2等6个蛋白点,可能是赤芍疗效的分子机制。张萃等筛选抗炎活血化瘀中药单体,发现丹参酮ⅡA对内毒素诱导的炎症细胞模型有明显抑制作用,双向电泳图像分析筛选出差异性明显的蛋白质点26个。4研究中蛋白学和基础学问题运用蛋白质组学的思路和方法研究中医药理论,虽然已经取得了一定的进展,但目前对该类研究报道依然较少。经检索PubMed及CNKI、维普等英文和中文数据库,至目前为止,有关中医药蛋白质组学的实验研究报道不足40篇,而纯理论思考的文献也仅150余篇;相对而言,思考的多,做的少。就实验研究方面,也存在明显不足:(1)相当部分研究仅停留于蛋白质成分分离和差异蛋白点显示,未进一步采用质谱等鉴定分析。或虽进行了质谱分析,但未辅其他佐证如Westernblot等(排除假阳性),也未对差异靶点之间进行生物学分析,未对差异靶点的确切意义进行深入研究,使实验结果的应用价值受到影响。(2)研究结果大多为表象描述。因为,蛋白差异表达也可能是平行发生或者晚期事件,而并不确定是造成证候变化或药物干预效果的必然原因(早期事件),几乎所有实验报道均未证实差异蛋白表达是必要的早期事件。(3)在证候造模的蛋白组学研究中,大多数研究者未排除造模药物或方法的干扰(缺乏必要的对照),而简单地定论为证候差异蛋白。此外,单纯证候研究的方式不足以反映中医特色。(4)对表达丰度较低的重要蛋白组的研究不足,采用考马斯亮蓝染色,可能造成对信号通路蛋白、磷酸化蛋白等表达丰度较低的重要蛋白的敏感性较差。此外,对亚细胞蛋白组如细胞膜、高尔基体、线粒体蛋白组的研究未见报道。(5)对许多基本理论如藏象学说、五行理论等,对许多重大疾病如癌症等,目前尚无或极少有关中医药蛋白质组学的研究报道。5中医证候研究的对策建议针对上述问题,建议采取以下对策:(1)中医药研究者也应经常关注生物医学研究进展,了解更多的生物技术。经常阅读SCI医学文献是可行的,也极为重要。影响因子5以上的SCI文献,对于培养严谨的研究思维十分有益。(2)利用各种生物学数据库,对差异蛋白进行信息学分析,初步预测差异蛋白之间的相互联系,以及可能参与的信号通路网络。(3)对于临床证候研究,建议采用方、证结合分析,采用对同一患者证候前后变化的追踪分析。对于造模证候研究,建议对证候发生的早、中、晚期分别研究,明确差异蛋白表达是否属于具有意义的早期事件。此外,无论临床还是造模证候研究,建议加设另一对照组,尽可能排除药物或方法造成的干扰。(4)对可能重要的差异蛋白进一步深入研究,适时引入基因过表达或RNA干扰、反义核酸技术等,以明确差异蛋白在中医证候和中药调节中的必要作用。(5)以蛋白质组学的筛选研究为基础,利用系统生物学的思路和技术,对具有确切作用的重要靶蛋白进行更为深入的中医药相关研究。(6)由于中药作用多靶点、多层次的特点,以及中医证候的复杂因素等,在中医药蛋白质组研究中,极可能筛选出某些未能确知生物学功能的差异蛋白,而这恰恰是后基因组研究的主要内容。根据研究结果提示,并参考上述对策,行生物学作用鉴定,那必将成为中医学对生命科学研究的重要贡献。(7)对于蛋白质检测,可根据需要灵活采用不同分辨率的染色技术。最常用的考马斯亮蓝染色的灵敏度在100ng左右。而银染法的灵敏度在1～10ng,经改进后也可用于分析鉴定。荧光染料syprored和syproorange灵敏度也在1～10ng,染色动态范围也比银染大,可达3个数量级。此外,改进的电泳技术还可在同一图谱上显示差异表达蛋白,从而简化了分析和减少了误差。6中药药代动力学研究中存在的问题蛋白质组学研究进展迅速,已成为后基因组时代最主要的研究体系。中医药蛋白质组学研究为揭示疾病状态下的代谢调控规律,探讨重大疾病的病因