银屑病患者与健康患者外周血h1h2细胞表达的比较

银屑病患者与健康患者外周血h1h2细胞表达的比较

银屑病属于中医学的“白象”范畴。现代中医著名专家赵炳南认为，本病属于血分。快性期主要是血液温暖，主要是肌肉表面感染，也是风、冷、湿等因素引起的。静态期主要是血液抑制。在疾病的发展过程中，不同的症状可能会同时发生，直到它们相互补偿。而在现代医学认为该病是多基因遗传背景下的T细胞失常的免疫性疾病,尤其是T辅助细胞(Thelpercell,Th细胞)亚群Ⅰ型T辅助细胞(Thelpercell1,Th1)和Ⅱ型T辅助细胞(Thelpercell2,Th2)的平衡失调以及相关细胞亚群产生的细胞因子如γ-干扰素(γ-interferon,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)等在银屑病发病机制中发挥作用,其主要作用在于促进银屑病免疫病理损伤。本研究探讨银屑病血热及血瘀证与外周血Th1/Th2细胞轴漂移的相关性,以Th细胞免疫学机制阐释不同证候银屑病发病转归的意义。病例选择及一般资料1西医诊断标准皮损边界清楚,红色斑丘疹,表面覆盖多层银白色鳞屑,轻轻搔抓易脱落,露出淡红色半透明薄膜,刮去薄膜可见点状出血(Auspitz征阳性)［2］。2中医证候诊断标准血热型:皮疹色红,新疹不断出现,鳞屑较多,易于剥除,基底有点状出血,瘙痒,常伴有口干舌燥,心烦易怒,便干溲黄。舌质红,苔黄腻,脉弦滑。血瘀型:皮损反复不愈,皮疹多呈斑块状,鳞屑较厚,颜色暗红;舌质紫暗有瘀点、瘀斑,脉涩或细缓。［3］3纳入及排除标准纳入标准:符合诊断标准;年龄18~65岁;病程0.1~20年;所选病例均为新发或最近2个月未作任何治疗,且无其他疾病史者;患者及正常志愿者均签署知情同意书。排除标准:3个月内曾采用系统治疗,包括大面积外用强效糖皮质类固醇激素、免疫抑制剂;合并有心、脑血管,消化、泌尿和造血系统等严重原发性疾病,精神病患者;哺乳期、妊娠或拟妊娠的妇女。4临床资料30例寻常型银屑病病例来源于2011年9月—2012年4月本院皮肤科,其中门诊患者16例,住院患者14例,按中医辨证分为血热证组15例,血瘀证组15例,两组性别均为男性8例,女性7例;血热证组年龄24~65岁,平均(46.20±13.97)岁,病程2个月~7年,平均(3.26±2.98)年;血瘀证组年龄30~64岁,平均(46.13±16.24)岁,病程2~9年,平均(4.97±2.12)年。两组年龄、性别和病程比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有患者均进行银屑病皮损面积和严重程度指数评分(thepsoriasisareaandseverityindexscore,PASI评分),血热证组PASI评分为(15.8±8.6)分;血瘀证组PASI评分为(7.4±3.3)分。另选同期上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院体检中心的体检者16名作为健康对照组,通过健康查体和血生化检查排除高血压、糖尿病、冠心病、高脂血症及肝、肾疾病,肝、肾功能检查正常。其中男8名,女8名;年龄23~65岁,平均(42.31±13.61)岁,3组间性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。5观察指标及方法抽取患者及健康人外周静脉血5mL(肝素抗凝),1000r/min离心5min后取血浆-80℃冰箱冻存备测,ELISA检测血清中Th1细胞表达的主要细胞因子IFN-γ和Th2细表达的主要细胞因子IL-4的水平:具体实验步骤参照抗人IFN-γ及IL-4ELISA试剂盒说明书进行。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(theperipheralbloodmononuclearcells,PBMCs)。流式细胞仪检测CD4+T细胞内细胞因子IFN-γ、IL-4的表达,取分离出PBMCs,5000r/min离心5min,去上清后再加磷酸缓冲液(phosphatebufferso-lution,PBS),再次5000r/min离心5min,弃上清,加250μLPBS重悬,200μL/孔PBMC细胞悬液铺入96孔板,加试剂(PMA100ng/mL,离子霉素1μg/mL,莫能霉素2μmol/L)刺激6h后收细胞,300μLPBS,振荡2000r/min离心5min,去上清后加50μLPBS,再加5μLCD4,孵育10min后,加300μLPBS,振荡2000r/min离心5min,去上清加胞内固定液500μL,30min后再加500μL胞内穿膜液,2000r/min离心5min,去上清加70μL胞内穿膜液,分别加抗体IFN-γ和IL-4后振荡过夜。加500μL胞内穿膜液振荡2000r/min离心5min,去上清加300μL胞内穿膜液上流式细胞仪分析。6统计学方法采用SPSS13.0软件进行统计,计量资料如正态分布以ue0af±s表示,成组比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD检验。不符合正态分布者,采用非参数检验。相关性比较采用Spearman相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。13组外周血PBMCs中CD4+IFN-γ+表达的比较(表1,图1)血热证组外周血PBMC中CD4+IFN-γ+水平显著高于血瘀证组及健康对照组(P<0.05),且与PASI评分呈正相关(P<0.05)。2血热证组、血瘀证组银屑病患者及健康对照组外周血PBMCs中CD4+IL-4+表达(图2,表2)经秩和检验分析,3组CD4+IL-4+组间比较差异无统计学意义(P>0.05),血热证组、血瘀证组PBMC中CD4+IL-4+水平与PASI评分均无相关性(P>0.05)。3血热证组、血瘀证组银屑病患者及健康对照组外周血清中IFN-γ的表达(表3)血热证组银屑病患者外周血清中IFN-γ水平显著高于血瘀证组及健康对照组(P<0.05)。血热证组银屑病患者血浆中IFN-γ水平与PASI评分呈正相关(P<0.05);血瘀证组银屑病患者血浆中IFN-γ水平与PASI评分呈负相关(P<0.05)。4血热证组、血瘀证组银屑病患者及健康对照组外周血清中IL-4的表达(表4)血热证组银屑病患者外周血清中IL-4水平显著低于血瘀证组及健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。血热、血瘀证银屑病患者血浆中IL-4水平与PASI评分无相关性(P>0.05)。银屑病早在隋代《诸病源候论.干癣候》就记载:“干癣但有匡郭,皮枯索痒,搔之白屑出是也”［4］。近代国内诸中医名家按证候将其分为血热证、血瘀证等多种证候,而证候的分型对于辨证论治有极大的裨益。赵炳南先生认为本病当“血分论治”,急性期辨证以血热为主,兼风、寒、湿等因素,治以凉血活血为先［1］。顾氏外科(上海顾伯华、顾伯康兄弟为首的中医顾氏外科)［5］倡导用清热凉血之法犀角地黄汤加减治疗该病。朱仁康教授将“血分论治”深入至血热风燥和血虚风燥两证论治［6］。西医认为银屑病是多基因遗传背景下的T细胞失常的免疫性疾病,以表皮角化不全、角化过度,真皮毛细血管扩张、炎细胞浸润为病理特征［2］。其发病与免疫异常的关系表现在免疫细胞活化、细胞因子释放、免疫表型及免疫球蛋白异常表达等方面。银屑病发病的细胞免疫过程包括下列3方面:(1)抗原诱导DC成熟,继而释放在银屑病发病中起主导作用的细胞因子,如白介素-23(IL-23)［7］、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)等。(2)T细胞活化、分化与增殖;(3)活化T细胞迁移到皮肤,产生炎症因子并发生级联反应［8］。目前公认Th细胞的失衡与银屑病的发病密切相关。Th细胞分为Th0、Th1、Th2、Th17、T调节细胞等亚型。Th1细胞是Th0细胞在IL-12等细胞因子作用下分化而成,Th1细胞为CD4+细胞,主要分泌白细胞介素-2(IL-2)、IFN-γ、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)等,T-bet为其关键的细胞转录因子。其功能为参与调节细胞免疫,辅助细胞毒性T细胞分化,介导细胞免疫应答,参与迟发型超敏反应等。Th2细胞是Th0细胞在IL-4等细胞因子作用下分化而成,主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-13等细胞因子,GATA-3为其关键的细胞转录因子,主要功能为辅助B细胞增殖、分化,介导体液免疫应答,参与Ⅰ型超敏反应等。Th细胞与银屑病的相关性研究在西医领域普遍开展,但其与银屑病中医证候的研究目前尚未见报道。本课题就最常见的Th1/Th2细胞与血热、血瘀证银屑病发病的相关性作一探讨。西医领域方面吴苗等［9］研究了寻常型银屑病外周血单一核细胞中T-bet和GATA-3的基因表达,结果表明寻常型银屑病患者血清中IFN-γ的水平明显高于健康对照组,IL-4的水平明显低于健康对照组;患者PB-MCs中转录因子T-bet的表达明显高于健康对照组,GATA3的表达明显低于健康对照组,上述结果提示Th1特异性转录因子T-bet可能通过调节Th1型细胞因子IFN-γ的产生介导寻常型银屑病的发生和发展。本研究将银屑病Th免疫学发病机制与白疕中医证候的相关性进行探讨,观察血热、血瘀证银屑病患者与健康对照组外周血Th1/Th2细胞表达的差异,研究血热、血瘀证银屑病的发病与外周血Th1/Th2细胞轴漂移的相关性。结果显示血热证组银屑病外周血血清IFN-γ及PBMC中CD4+IFN-γ+的表达显著高于血瘀证组及健康对照组,且与银屑病皮损的严重程度(PASI评分)呈正相关,提示血热证银屑病的发病与外周血Th1细胞密切相关,外周血Th1细胞在血热证银屑病的发病中占主导地位,当血热证银屑病向血瘀证转化或正常转归时,外周血Th1细胞的表达下降;虽然血热证组银屑病患者外周血清中IL-4