基于uplc-ms和uplc-ms技术的土茯苓抑制黄嘌呤氧化酶活性研究

基于uplc-ms和uplc-ms技术的土茯苓抑制黄嘌呤氧化酶活性研究

高尿酸血症是痛风的重要因素。高尿酸过量、肾衰竭或总体影响导致高尿酸血症的发生。目前，该病已成为糖尿病的第二代绵延病。黄嘌呤氧化酶(XanthineOxidase,XOD)能催化黄嘌呤和次黄嘌呤氧化生成尿酸,并产生过氧化物自由基。因此XOD抑制剂通过抑制XOD的活性来减少尿酸生成,用作降尿酸药物。目前临床上常用的XOD抑制剂别嘌呤醇及促进尿酸排泄药痛风利仙,由于副作用大限制了其在临床上的应用,因此从中草药及天然药物中寻找新型抗痛风和高尿酸血症药物成为药学研究的一个热点。土茯苓,别名土萆薢,为百合科植物光叶菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥根茎,具有除湿、解毒、通利关节的功效。临床常用土茯苓治疗高尿酸血症及痛风。研究显示,土茯苓具有降尿酸作用,对体外XOD活性具有明显的抑制作用。土茯苓主要有黄酮类、有机酸类等成分,其中黄酮类成分有明显的抗炎、镇痛作用,但降尿酸活性物质不清。为进一步研究土茯苓降尿酸活性的物质基础,本研究以体外XOD活性为指标,系统分离筛选土茯苓抑制XOD活性的有效部位,再用UPLC-MS及HPLC分析有效部位成分,进行活性评价,明确土茯苓抑制XOD活性的物质基础。1仪器、试剂和测试剂WatersAcquity超高效液相色谱仪,配有二极管阵列(DAD)检测器;WatersQ-TOFmicro质谱仪,配有电喷雾离子源(ESI);Masslynx4.1工作站(美国Waters公司)。Waters515高效液相色谱仪,配有2487单波长检测器,717自动进样器;Empower色谱管理软件(美国Waters公司)。752紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司);UV-2401紫外分光光度计(日本岛津公司)。氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(化学纯,购自上海久亿化学试剂有限公司);亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(分析纯,购自上海新宝精细化工厂);黄嘌呤氧化酶(XOD)、二甲基亚砜(DMSO)、黄嘌呤(购自Sigma公司);氯化硝基四氮唑蓝(NBT,购自上海宝曼生物科技有限公司);磷酸缓冲液(pH7.9,50mmol/L)等均为分析纯。土茯苓购自安徽亳州,由南京中医药大学王春根教授鉴定为百合科植物光叶菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥根茎。芦丁(批号:ZL20100207LD)、落新妇苷(批号:ZL20090917LD)、槲皮素(批号:ZL20090928LD)、柚皮素(批号:ZL20090411LD)、表儿茶素(批号:ZL20101217LD)等对照品,均购自南京泽朗医药科技有限公司,HPLC分析质量分数均大于98.0%。2方法和结果2.1各种溶剂的xod活性评价2.1.1xod抑制活性测定XOD催化黄嘌呤生成尿酸,尿酸与氯化硝基四氮唑蓝反应生成紫色的formazan,当XOD的活性受到抑制后,生成的尿酸量减少,紫色formazan的生成也就随之减少,通过在560nm下测定生成的紫色formazan的吸光度来检测XOD抑制活性的大小。2.1.2萃取部位待测液制备取土茯苓药材粉末50g,用10倍量70%乙醇渗漉提取,合并渗漉液,回收至无醇味,用蒸馏水定容至50mL,即为土茯苓样品溶液。量取土茯苓样品溶液5mL置分液漏斗中,依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,分别回收溶剂至干,用70%乙醇溶解并定容至10mL,得氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位样品。精密量取各溶剂部位及土茯苓样品溶液适量,挥干溶剂,经DM-SO溶解,配制成50mg生药/μL溶液,即为各萃取部位待测溶液。分别精密称取落新妇苷、芦丁、槲皮素、柚皮素、表儿茶素对照品适量,经DMSO溶解,配制成1μg/mL溶液,即为对照品溶液。2.1.3xod活性测定吸取1.2mL磷酸缓冲液至5mL容量瓶中,再分别加入1.5mL黄嘌呤溶液(2.0mmol/L)和0.2mLNBT(1.8mg/mL),摇匀,即为XOD活性测定用空白溶液。再往该空白溶液加入1.2mLXOD溶液(0.08U/mL),摇匀,即为XOD活性测定用XOD溶液。以XOD溶液的加入开始计时,25℃反应30min后,在560nm波长下以空白溶液为对照,测定XOD吸光度A0。2.1.4土茯苓茯苓样品对xod活性的影响精密吸取“2.1.2”项中土茯苓样品溶液及各萃取部位待测样品溶液各30μL置于5mL容量瓶中,按“2.1.3”项下操作分别得到样品XOD抑制活性测定用空白溶液以及样品XOD抑制活性测定用XOD溶液。以XOD溶液的加入开始计时,25℃反应30min后,在560nm波长下以空白溶液为对照,测定XOD吸光度As。结果见表1。土茯苓样品对XOD活性具有较强的抑制作用。在各萃取部位中,乙酸乙酯部位对XOD活性的抑制作用最强,且超过土茯苓样品,正丁醇及水部位抑制作用较弱,表明乙酸乙酯部位为土茯苓抑制XOD活性的有效部位。2.1.5so吸光度测定分别取2.5、5.0、10.0μL乙酸乙酯部分的DMSO溶液置于5mL容量瓶中,按“2.1.3”项下操作测定吸光度,结果见表2。乙酸乙酯部位在125~500μg范围内对XOD活性的抑制作用具有量效关系。2.2乙酸乙酯系统分析2.2.1对照溶液的制备取芦丁对照品适量,干燥至恒重,精密称定,加入70%乙醇溶液配制成0.2320mg/mL的对照品溶液。2.2.2土茯苓茯苓总黄酮检测波长的确定分别取芦丁对照品溶液及上述土茯苓样品溶液适量于25mL容量瓶中,加入5%亚硝酸钠溶液1mL,摇匀,放置6min,加入10%硝酸铝溶液1mL,摇匀,放置6min,再加入10%氢氧化钠溶液10mL,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,15min后于UV-2401紫外分光光度计中扫描测定,对照品及样品溶液均在500nm处有最大吸收峰,由此确定测定土茯苓总黄酮的最佳检测波长为500nm。2.2.3线性范围精密量取芦丁对照品溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL分别置于25mL容量瓶中,按“2.2.2”项下操作,在500nm处以相应试剂为空白,测定吸收度,根据样品量(X)和吸光度(Y)可得回归方程:Y=0.5308X-0.0054,r=0.9999(n=6),线性范围为0.4640~1.0440mg。2.2.4重现性与稳定性连续5次精密量取同一份样品溶液,按照“2.2.2”项下操作测定吸光度,RSD值为2.36%,表明该方法精密度良好。精密称取5份药材,按照样品制备方法进行制备,按“2.2.2”项下操作测定吸光度,RSD值为2.48%,表明该方法重现性良好。精密吸取一定量样品溶液,按照“2.2.2”项下操作,在0、5、10、15、30、60min测定吸光度,RSD值为0.76%,表明该样品在60min内稳定。精密称取6份已知含量的土茯苓药材1.0g,分别精密加入1.0、2.0、3.0mL芦丁对照品溶液,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.2”项下方法测定含量,结果见表3,表明该方法准确。2.2.5黄酮转移率测定分别取“2.1.2”项中土茯苓样品溶液和乙酸乙酯部位溶液,按“2.2.2”项下操作测定黄酮含量。乙酸乙酯部位黄酮转移率为62.50%,质量分数为92.13%。表明乙酸乙酯部位主要为黄酮类成分。2.3乙酸乙酯系统分析2.3.1冰醋酸溶液b色谱条件:分离采用AcquityT3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm);流动相甲醇(A)-1.5%冰醋酸(B);梯度洗脱,0~15min,20%~45%A,15~21min,45%~75%A,21~25min,75%~85%A。质谱条件:ESI(-),干燥气流速10L/min,干燥气温度350℃,毛细管电压3200eV,雾化室压强275.8kPa,分流比1∶4,扫描范围m/z100~1000。2.3.2b-1.5%冰醋酸溶液采用DiamonsilC18色谱(250mm×4.6mm,5μm);流动相甲醇(A)-1.5%冰醋酸(B);梯度洗脱,0~60min,10%~45%A,60~85min,45%~75%A,85~95min,75%~85%A,95~100min,85%~10%A。进样量10μL,柱温30℃,检测波长280nm。2.3.3质谱分析取“2.1”项中乙酸乙酯部位样品经UPLC-ESI-MS分析,得质谱总离子流图(图1)。依据各色谱峰的分子离子峰及主要碎片峰的解析、与文献对比及HPLC法与对照品比对,确定了乙酸乙酯部位中7个黄酮类成分,结果见表4。2.4黄酮类化合物xod活性评价3不同部位黄酮类成分对xod活性的影响本研究系统分离土茯苓各溶剂部位,以体外XOD活性为指标,评价其抑制XOD活性作用,结果显示,乙酸乙酯部位抑制XOD活性的作用强于原药材,表明土茯苓药材中抑制XOD活性的物质基础主要集中于乙酸乙酯部位中。经黄酮含量分析表明,土茯苓黄酮类成分是抑制XOD活性的有效部位。再以UP-LC-MS分析及HPLC对照品比对,确认了黄酮部位中表儿茶素、落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷、槲皮素、柚皮素7个成分,进一步评价其抑制XOD活性显示,表儿茶素、落新妇苷、槲皮素及柚皮素为土茯苓抑制XOD活性的物质基础。目前国内外对治疗高尿酸血症植物药的研究发现,黄酮类成分是通过抑制XOD活性及促进尿酸排泄等多途径多靶点防治高尿酸