代谢组学的研究进展

代谢组学的研究进展

代谢组学是最近发展起来的一门学科，是基因组学、转换组学和蛋白质组学的重要组成部分。代谢组学主要研究生物对外源性物质所引起的病理生理反应,以及对遗传变异的应答和内源性代谢物的动态变化,它通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢物进行检测、确定、定量和分类,将这些代谢信息与病理生理过程中生物学事件关联起来,以监测活细胞中化学变化。基因组学和蛋白质组学分别从基因和蛋白质层面探寻生命的活动,而实际上细胞内许多生命活动是与代谢物相关的,是受代谢物调控的。基因与蛋白质的表达紧密相连,而代谢物则更多地反映了细胞所处的环境,这又与细胞的营养状态、药物以及其它外界因素的影响密切相关。因此,有学者认为,基因组学和蛋白质组学能够说明可能发生的事件,而代谢组学则反映确实已经发生了的事情。代谢组学强调把人体作为一个完整的系统来研究,通过测定人体各种体液内代谢物的组成变化来认识和反映人体代谢网络在疾病和药物作用下的变化规律。这对于揭示复杂性疾病的机理和药物的代谢模式具有独特的优势,与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维非常吻合,也与中医重视从人与自然、人与社会和人体内在的普遍联系和动态变化去分析、认识把握疾病发生、发展、变化的客观规律的认识一致。因此,专家认为,人类基因组计划第一次使西方医学摆脱了还原论的束缚,在继续强调分析的同时,更加重视分析和综合的统一。人类基因组计划和随后发展的各种“组学”技术把生物学研究带入了系统科学的时代。组学的出现不是对个别基因或个别蛋白、代谢物的研究,而是对一个细胞或对整个生命体的基因以及它所编码的蛋白质和代谢产物的研究。物理学、化学、计算机科学、信息科学、工程科学现在都已极大地融合到生命科学的研究之中,重视生命科学的复杂性和整体性研究已成为21世纪生命科学的发展趋势;甚至有专家认为,中西医药学在各自的发展中逐步整合,形成创新医药学体系的历史机遇正悄然来临。1代谢组学流程代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物(MW<1000)。其样品主要是尿液、血浆或血清、唾液以及细胞和组织的提取液。完整的代谢组学流程包括样品的采集、预处理、数据的采集和数据的分析及解释。主要技术手段是核磁共振(NMR)、液-质联用(LC-MS)、气-质联用(GC-MS)、色谱(HPLC、GC)等。通过检测一系列样品的谱图,再结合化学模式识别方法,可以判断出生物体的病理生理状态、基因的功能、药物的毒性和药效等,并有可能找出与之相关的生物标志物(biomarker)。1.1代谢指纹图谱与代谢组学在代谢组学的研究中最常见的分析工具是NMR,主要是氢谱(1HNMR)、碳谱(13CNMR)及磷谱(31PNMR)三种,特别是1HNMR。NMR是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下,吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。该技术于20世纪70年代初开始应用于生物医学的研究并得到迅速发展。利用高分辨率NMR技术对完整器官或组织细胞内许多微量代谢组分进行检测,可得到相应的生物体代谢物信息,研究这些组分的NMR图谱,综合分析这些信息所反映的生物学意义,可以了解生物体代谢的规律,得出科学的结论。NMR方法具有无损伤性,不会破坏样品的结构和性质,可在接近生理条件下进行实验,可在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件;可以进行实时和动态的检测;可设计多种编辑手段,实验方法灵活多样,满足了代谢组学对尽可能多的化合物进行检测的目标。NMR还有一个重要的特点,就是没有偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的。1HNMR谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一对应的,所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关的谱峰,图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量。因此,NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂成分。从一维高分辨1HNMR图可得到代谢物成分图谱,即代谢指纹图谱。对这种特质性进行区分、鉴定,被称为“代谢指纹分析(metabolicfingerprintanalysis)”,帮助找出机体代谢的共性与个性。对某一代谢物或组合随时间变化的情况鉴定描述称之为“代谢轮廓分析(metabolicprofilinganalysis)”,观察特定干预的动态系统中,找出机体代谢变化的规律。随着NMR技术的发展,以前用于固体的魔角旋转(MAS)技术被移植到液体领域,使得人们可以研究以前难以用液体NMR研究的样品,如器官组织样品。利用MAS技术,人们可以得到完整的组织样品高分辨谱图,扩展了代谢组学研究的样品范围,同时可以更全面地对一个系统进行深入的研究。在得到1HNMR谱图之后,通常以δ0.04为单位,将谱图划分成若干区域,并对所有区域进行积分,然后将积分值归一化后输出。在得到了这些数据之后,就可以利用模式识别(pattenrecognition,PR)方法来处理和分析这些数据,得出有价值的生物学信息。在代谢组学的研究中,最简单常用也是比较有效的模式识别方法是主成分分析法(principalcomponentanalysis,PCA)。PCA的特点是将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标即主成分(principalcomponent,PC)上,利用这些主成分来描述数据集内部结构,实际上也起着数据降维的作用。主成分是由原始变量按一定的权重经线性组合而成的新变量,这些变量具有以下性质:①任意两个主成分之间都是正交的;②第1个主成分包含了数据集的绝大部分方差,第2个主成分则次之,依次类推。这样,由前2个或3个主成分作图,就能够很好地反映数据集所包含的生物化学变化。这样的主成分图能够直观地描述药物作用到器官之后,或者基因改变之后生物体内的代谢模式的变化。每一个样本在主成分图上的位置纯粹由它的代谢反应所决定。在这种比较简单的方法中,将从受试动物得到的样本与NMR产生的代谢组数据库进行比较,就可以确定它在主成分图上的位置,从而确定其机制,并有可能找到生物标志物。处于相似病理生理状态的动物得到的样本通常具有相似的组分,因此,在主成分图中也处于相似的位置。另外,一些环境因素和性别、饮食等因素都会影响分析结果,故需要采用滤噪技术,如正交信号校正(orthogonalsignalcorrection),同时采用更为复杂的分析方法,如偏最小二乘法、判别分析(PLS-DA)和人工神经网络。用这类方法可以建立复杂的数学模型,对未知样本进行预测分析。NMR技术在代谢组学中的应用越来越广泛,但仪器价格及维护费用昂贵限制了该技术的进一步普及。1.2nmr检测结果主要有质谱(MS)技术是将离子化的原子、分子或是分子碎片按质量或是质荷比(m/e)大小顺序排列成图谱,并在此基础上,进行各种无机物、有机物的定性或定量分析。新的离子化技术则使质谱技术的灵敏度和准确度均有很大程度的提高。将预处理的体液或是组织,加至质谱仪,经历汽化、离子化、加速分离及检测分析后即可得出相应代谢产物或是代谢组的图谱。图谱中每个峰值对应着相应的分子量,结合进一步的检测分析可以部分鉴定出化学成分以及半定量关系。不同组别的质谱图存在差异,加以区别、鉴定,亦有助于研究代谢的变化规律及标志性代谢产物。NMR技术与MS技术相比,各有其优缺点,需要在研究中灵活选用。总体而言,NMR技术应用的更为广泛。此外,根据代谢组学的研究需要,还常用于其他的一些分析技术,如GC、HPLC、高效毛细管电泳(HPCE)等,它们往往与NMR或MS技术联用,进一步增加其灵敏性。2代谢组学:中医证候的量化辨证论治是中医药理论的核心。其实质是根据个体心身特点及其当时的疾病反应状态而有针对性地进行个体化的治疗和预防,从而达到最佳治疗效果。中医的“证”是论治的起点和核心。“证”是指在疾病的发生、发展过程中,一组具有内在联系的、能够反映疾病过程在某一阶段的病理病机,是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态,其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群。辨证施治既不同于对症治疗,也不同于西医的辨病治疗。由于每一个证候都有其外象(外候)与内涵,外候是望、闻、问、切四诊所获得的信息整理而得,很难量化,即使用流行病学方法加以演绎,依靠专家的经验打分,最多亦只是半定量,很大程度上依赖于医生的诊疗水平。由于辨证是由外揣内,在具体运用上受到医患双方主观因素的影响,难以客观化和量化,所以必须通过“证”的内涵研究。采用代谢组学技术,通过对某一病证相关特定组分的共性加以分析、判断,能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况;同时,代谢组学还有助于疾病的生物标记物的发现而达到辅助临床诊断的目的。它能够通过检测不同时间患者的尿液或血液,对这些由疾病引起的代谢产物的响应进行分析,即代谢物组的分析,其准确性依赖于仪器的性能,可以提高诊治的科学化、定量化,避免了人为因素的误诊。成都中医药大学王米渠教授用基因芯片的方法研究中医寒证患者,发现寒证的基因表达谱有显著差异,在59条差异表达基因中,绝大多数与代谢(能量代谢、蛋白质代谢等)有关,说明寒证患者的代谢网络有别于常人。上海交通大学药学院实验室采用代谢组学研究发现肾阳虚模型动物的代谢网络明显偏离正常组动物,而用温阳中药干预后,模型动物的代谢谱回归至正常范围,呈现网络修复的结果。本课题组以慢性束缚方法制作应激大鼠模型,运用动物行为学评定和以方测证等方法确定该模型为肝郁脾虚证候模型。经NMR数据采集与分析发现:①正常组与模型组之间存在代谢产物谱的显著差异,也就是说正常组与以慢性束缚方法制作应激大鼠肝郁脾虚证模型组之间有着代谢产物的不同。②模型组随着造模时间长短的不同,其代谢产物有所变化。③中医证候之间可能存在着非常明显的代谢产物的不同,这种不同是基于不同证候存在着不同物质代谢或其代谢网路的改变。中医证候的生物学基础也可能从代谢组学研究中找出特异的标志性代谢产物,用生物信息学方法分析生物标志物的功能,来确定“证相关代谢谱群”。基于这些研究,我们提出中医证候的定义:证是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态,其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群,其本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变。3生理条件的影响中医证候代谢组学研究技术是通过采集证候样本或模型动物的血浆、尿样品并进行代谢产物谱分析,得到各自的代谢产物谱,找出特异的标志性代谢产物,用生物信息学方法分析生物标志物的功能,以确定“证相关代谢谱群”。也可以用方证反证的方式验证方药的作用机理和进行方证相关性的研究。值得注意的是,现已证明动物体的内源性代谢产物与生理条件下的各种变化有关,如性别、年龄、个体间的健康状况、遗传差异性、外源因素昼夜节律更替、饮食、温度、觉醒等刺激,甚至周围气候不同、菌群的改变,代谢组也可发生种类及数量的差别。因此,建立生理条件下对代谢谱的正确认识,是研究各种病理条件或刺激干预的前提。代谢组学正处于快速发展的阶段,日益成为研究的热点。高通量、高分辨率的分析技术与生物信息学相整合,从生物代谢层面进行研究,提供了了解生物体的独特视角。代谢组学研究侧重于寻找相关特