质粒的基本知识

质粒的基本知识染色体外的稳定遗传因子,大小从l-200kb不等,共价闭合环状，超螺旋具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所带的遗传信息。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。O-抗菌素抗性基园—控制慣粒OL

转移的基因质粒拷贝数质粒种类拷贝数复制起始点拷贝类型质粒PUC18/19载体500-700pMB1高拷贝pBluescript载体300-500ColE1高拷贝pGM—T载体300-400pMB1高拷贝pTZ载体>1000pMB1高拷贝pBR322载体15-20pMB1低拷贝pACYC及其衍生载体10-12p15A低拷贝PSC101及其衍生载体~5pSC101低拷贝粘粒SuperCos10-20ColE1低拷贝pWE1510-20ColE1低拷贝抗生素抗生素贮液浓度保存条件工作浓度严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素50mgml（溶于水）—20°C20hg/ml100hg/ml羧苄青霉素50mgml（溶于水）—20°C20hg/ml100hg/ml氯霉素34mgml（溶于无水乙醇）-20C34hg/ml170hg/ml卡那霉素10mgml（溶于水）-20C10hg/ml50hg/ml链霉素10mgml（溶于水）-20C10hg/ml50hg/ml四环素5mgml（溶于无水乙醇）-20C10hg/ml50hg/ml质粒DNA提取方法碱裂解法煮沸法CsCl法高浓度NaCl法双相法（聚乙二醇、葡聚糖二相）碱裂解法原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离。在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性；共价闭环质粒DNA变性但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。实验者关心的因素质粒的纯度一一与下游反应密切相关得率－－根据个人需要选择不同的纯化量速度/方便性经济性质粒DNA提取试剂盒

每个离心柱处理的菌液量依据不同试剂盒中的吸附柱类型而定RNAase溶液(10mg/ml)平衡液BL溶液P1、P2、P3漂洗液PW洗脱缓冲液EB吸附柱(CB3、CB4、CB5)收集管质粒DNA提取试剂盒小提小提中量高纯度小提高纯度小提中量质粒大提酵母1-5ml5-15ml1-5ml5-15ml100-200ml1—5mlCB3CB4CB3CB4CB5CB240ug70ug40ug70ug1000ug20ug缓冲液PD缓冲液PD缓冲液PD大肠杆从菌中提取质粒DNA实验操作流程材料准备菌体收集收集保存菌体培养大肠杆菌：挑选单菌落，37°C，过夜培养。材料选择与准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）实验前准备溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8C保存。第一次使用前先在漂洗液PW中加入适量无水乙醇。提取低拷贝的质粒或者大质粒时洗脱缓冲液EB在65-70C水浴预热。菌体收集

高拷贝质粒：收集1・5-3ml菌液（质粒小提试剂盒）。如果质粒的拷贝数低，可以适当增加收集的菌液量，而随后溶液P1、P2、P3/4的用量也要相应地增加。不同试剂盒中收集菌液的量与溶液加入量駁log鹿□琰茞□濾。质粒小提/高质粒小提中量/高纯度质粒小提纯度质粒小提中量质粒大提菌液的量1-5ml5-15ml100-200ml溶液P1250ul500ul7ml溶液P2250ul500ul7ml溶液P3350ul700ul10ml漂洗液PW（第一次）700ul700ul10ml漂洗液PW（第二次）500ul500ul10ml洗脱液EB50-100ul100-300ul1-2ml菌体悬浮向留有菌体的离心管中加入适量溶液P1，使细菌细胞彻底悬浮混匀。菌体裂解向离心管中加入适量溶液P2,温和地翻转6-8次使菌体充分裂解。裂解中和向离心管中加入适量溶液P3,立即温和地翻转6-8次，充分混匀。此时可能会出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟，将上清小心地移入离心管中。质粒DNA吸附、洗涤小心将上一步得到的溶液加入吸附柱中，13,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。向吸附柱中加入700ul漂洗液PW, 13,000rpm离心30秒，倒掉离心管中的废液。向吸附柱中加入500ul缓冲液PD,13,000rpm离心30秒，倒掉离心管中的废液。将吸附柱放回离心管中，13,000rpm空柱离心2分钟，倒掉离心管中的废液。质粒洗涤Q&AQ-1：为什么要进行空柱离心？A-1：空柱离心是为了去除多余的乙醇残留。空柱离心后可将吸附柱在室温或者超净台风干数分钟，再进行下步操作。质粒DNA洗涤一高纯度质粒提取试剂盒向吸附柱中加入500ul缓冲液PD，13,000rpm离心30秒，倒掉离心管中的废液。质粒DNA的洗脱收集将吸附柱转入干净离心管中，加入50-200卩1洗脫缓冲液EB，室温放置2-5分钟，13000rpm离心30秒，收集DNA。收集保存Q&AQ-1：洗脱缓冲液洗脱体积小为什么会影响洗脱效率？A-1：当洗脱液体积小于30ul时，洗脱效率较低且不稳定，而洗脱液体积在50-200ul范围内时，洗脱效率稳定在80-90%并可保证得到最大产量。Q-2：用无菌水洗脱为什么得率低？A-2：采用硅基质膜吸附分离DNA后，可将DNA在低盐高pH条件下洗脱下来，pH值在7.0-8.5之间有最大洗脱效率。而有些实验室的无菌水pH呈酸性，导致提取得率下降。如用无菌水洗脱，建议用NaOH将其pH调整到7・0-8・5之间后再进行洗脱。质粒提取常见问题分析1、 未提出质粒或者得率低菌体过少、过多或菌体老化、菌体中无质粒裂解不充分漂洗液和缓冲液中忘记加酒精或有乙醇残留洗脫液不合适、体积过少或洗脫时间过短质粒为低拷贝2、 提出的质粒为三条带或者三条带以上提取过程中，动作过于剧烈加入溶液P2后放置时间过长菌体中含有其它杂质粒菌体状态不好

有基因组DNA的污染3、提出