发酵工程制药-维生素和辅酶类药物的发酵制药

生物制药工艺课程辅酶Q10的发酵制药

辅酶Q10是辅酶Q类的重要成员之一，它是一种脂溶性醌类化合物，又称泛醌，万有醌等。其成品为黄色或淡橙黄色的结晶性粉末，无嗅、无味。熔点47－50℃。易溶于氯仿、苯、四氯化碳，溶于丙酮、乙醚、石油醚，微溶于乙醇，不溶于水、甲醇。结构中有异戊烯基，见光易分解，使颜色变深（微红色物质）。辅酶Q10简介

辅酶Q10广泛存在于酵母、植物的叶和种子，以及动物的心脏、脾脏、肝脏和肾脏中。在人体内，主要集中在肝、心、肾、肾上腺等组织，人体内辅酶Q10总含量在500-1500mg之间。辅酶Q10是重要的抗氧化剂和免疫增强剂。主要用于心肌梗死、狭心症、心律失常、窦性心动过速、早搏、高血压和癌症的辅助治疗等，以及用于急慢性病毒性肝炎、亚急性肺坏死的综合治疗。1.保护心脏、营养心肌心脏在运转中需要消耗大量的能量和营养，辅酶Q10有助于提高心肌携氧量，提高心肌活力。心肌活力提高，便能发挥更强劲的脉动能力。这样体内的血液循环就更加顺畅。同时辅酶Q10还能稳定心脏脉冲和心脏导电系统，减低患心律异常或心悸问题的风险。辅酶Q10的作用及作用机理辅酶Q10缺乏三羧酸循环抑制ATP下降血红细胞携氧能力下降心肌缺氧心肌细胞心脏能动力不足心肌缺血心脏病2.防治高血压辅酶Q10对血管能产生抗老化作用，使血管更具弹性，防止动脉硬化，血压自然也就更为平稳。3.抗衰老辅酶Q10通过直接与过氧化物自由基反应，并且可以再生vE，独力并协同vE发挥抗氧化剂的作用。有效清除体内自由基，延缓人体衰老。4.增强免疫力随年龄增长的免疫功能下降是自由基和自由基反应的结果，辅酶Q10作为一种强抗氧化剂单独使用或与维生素B6(吡哆醇)结合使用可抑制自由基对免疫细胞上受体与细胞分化和活性相关的微管系统的修饰作用，从而增强免疫系统，提高人体抵抗力。5.抗疲劳辅酶Q10是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢启动剂，具有保护和恢复生物膜结构完整性、稳定膜电位的作用，是机体的非特异性免疫增强剂，因此显示出很好的抗疲劳作用，辅酶Q10使细胞保持良好健康的状态，因而机体充满活力，精力旺盛，脑力充沛。6.保护皮肤 辅酶Q10可以减弱光子的氧化反应，在生育醇的协助下可以启动特异性的磷酸化酪氨酸激酶，防止DNA的氧化损伤，抗紫外线，保护皮肤免于损伤。7.增强肌肉能量人体内适当含量的辅酶Q10对于维持肌肉功能是必需的。辅酶Q10的浓度低于正常值的20%时，细胞线粒体复合体功能活性严重下降，导致能量供应不足，从而影响人体活动能力。每天补充100-150mg的辅酶Q10，可明显改善肌肉营养失调人的状况。辅酶Q10还可加速脂肪的代谢，清脂减肥，使肢体和大脑能量供应充裕，精力旺盛。8.抑制他汀类药物副作用他汀类药物在抑制胆固醇合成的同时也会抑制体内辅酶Q10的生成，老年病人身上更容易产生体内辅酶Q10不足的现象，在使用他汀类药物的同时一定要补充辅酶Q10，这样能够迅速缓解他汀类药物引起的肌痛和疲劳，抵消与他汀类药物有关的肌肉疼痛和肝脏损伤。9.抗肿瘤近年来的研究表明，辅酶Q10有抗肿瘤作用，此外辅酶Q10的补充对于经历阿霉素这样心脏毒性药物化疗的癌症患者也很重要。

第一点辅酶Q10含量多少，直接关系着心脏的安危，可以说，一切心脏病都从辅酶Q10缺失开始。德克萨斯大学研究证明，心脏病患者的辅酶Q10自身存量明显低于正常人群；心脏病情越重，辅酶Q10含量就越低。为此，研究人员在对600名年过百岁的老人进行体检时惊讶地发现，在这些寿星的血液中，辅酶Q10含量之高竟可与40岁的中年人相比。辅酶Q10无疑在“抢救心脏”中发挥了根本性、保护性、修复性、辅助性等不可代替、不可或缺的作用。四.人体为什么要补充辅酶q10

人体内辅酶Q10含量下降25%时，许多疾病就会产生，特别是心脏疾病；更加可怕的是辅酶Q10含量下降超过75%时，生命就会终止。人体缺少辅酶Q10，通常容易患冠心病，心力衰竭，心律失常，心肌梗塞等多种心脏疾病。

辅酶Q10对心脏保健作用主要表现为，抗心肌缺血，增加心输出量，降低外周血管阻力，有助于抗心衰和抗心律失常等，心脏病患者长期补充辅酶Q10，可根治心脏疾病。

第二点人体中辅酶Q10的总含量仅为500-1500mg，并随着人体年纪的增长，辅酶Q10的含量逐渐下降。一般超过20岁体内的辅酶Q10就会日渐稀少，到了60岁，体内辅酶Q10更是只有20岁时的三分之一。

辅酶Q10作为唯一体内合成的脂溶性抗氧化剂，在抗衰老、抗疲劳维持机体的青春及活力方面发挥着卓越的作用。对健康维持推荐的每日剂量为50mg，在治疗各种疾病中需要更高的剂量。心脏、大脑是辅酶Q10展现神奇功效的场所，这两个人体重要器官含有的辅酶Q10占人体总含量的60%。

衰老从心血管循环开始，心脏的劳损首当其冲，接着大脑的功能衰退。因此为了保护心脏，预防衰老，维持机体的青春及活力，我们就必须补充辅酶Q10。

饮食中的辅酶Q10摄取量很少，遇上胃肠功能不好的朋友，辅酶Q10的有效吸收率更加少。假如为了保证每天50mg的辅酶Q10补充量，让您一天吃下3斤牛肉，或者4斤猪肉这是谁都无法接受的。虽然蔬菜中辅酶Q10含量并不低，可是每天要吃下8斤蔬菜，又有谁能做得到呢？

补充辅酶Q10刻不容缓，势在必行！

二十世纪八十年代初期日本实现了从烟叶中提取茄呢醇为原料合成生产辅酶Q10，至使辅酶Q10成本大幅度下降，这对于辅酶Q10的应用、普及和推广起到了重要的推动作用。半化学合成法技术上比较成熟，已实现了工业化，产品成本低，价格适中。但是使用半化学合成法生产的产品虽然在价格上有优势，但在使用上比用生物提取法生产的产品有较大的差距。原因在于生物提取法生产的是天然的、有机的产品，易于被人体吸收转化，而化学合成法生产的是人工化学合成的有机产品，生物活性极差，不易被人体吸收，难以充分发挥辅酶Q10的药理作用。关于辅酶Q10化学合成方法一直是国内外研究的热点，近半个世纪来，经历了1977年发达国家实现了微生物发酵法生产辅酶Q10，近几年微生物发酵提取法得到了长足的发展，这种全新的生物工程方法，既综合了生物提取工艺和化学合成工艺两种方法的优点，又克服了它们的缺点，因此是最令人瞩目的有希望实现工业化的方法。

微生物发酵提取法实现工业化生产主要有两个方面要求：（1）要求有稳定的规模化生产工艺的高质量辅酶Q10的转基因菌种；（2）要求有高精度分离仪器的技术。日本是世界上最早也是最主要的辅酶Q10生产国。据统计，全球90%的辅酶Q10来自日本。辅酶Q10产量最高的两家日本公司是“日清制粉”和“协和发酵株式会社”。

中国从二十世纪七十年代开始进行辅酶Q10的技术研究，并很快建设了几条生物提取法生产线，主要从猪心肌中提取，国内采用生物提取工艺生产辅酶Q10单位主要有北京制药厂、泰州生物化学制药厂、青岛生物化学制药厂、杭州制药厂、长沙生物化学制药厂、浙江天台县制药厂、贵阳生物化学制药厂、个旧生物化学制药厂、太原市生物化学制药厂、大同市生物化学制药厂等十几家企业。总生产能力在600kg左右。

中国是世界上主要的烟草生产国，中国有大量不能用于卷烟的废次烟叶，未得到利用，造成环境污染和资源浪费。早在二十世纪七十年代后期中国就开始着手进行废烟叶提取茄尼醇的研究与开发工作。

二十世纪九十年代初期，中国投入了大量的精力进行辅酶Q10新工艺的研究，并取得了可喜的成果。河南大学烟草化学科技开发研究所与商丘烟草精细化工厂合作共同研究开发了利用烟草提取茄尼醇，在多年研究的基础上，于1996年元月正式实现工业化，可以年产100吨含量≥15%的茄尼醇粗品和20吨含量为≥75%的茄尼醇精品，为中国辅酶Q10的工业化生产打下了良好的基础。

开发的半合成法工艺是以对甲基苯酚为原料通过溴代，醚化、氧化获得甲基二甲氧基苯醒，然后与从烟草或马铃薯叶子中提取茄呢醇缩合得到辅酶Q10。该方法的关键是如何将侧链连接到母环上。全合成法

1988年Eem和Kanan开发的全合成法生产辅酶Q10工艺是唯一成功的全合成法技术，但是由于合成线性不饱和侧链存在一定难度。以及合成条件苛刻，与工业化还有一定的距离。

半合成法

醇一碱皂化制造法该工艺辅酶Q10的收率为61.2mg/kg新鲜猪心，这是国内普遍采用工艺。在乙醇的存在下，长时间的皂化可能导致辅酶Q10中的甲氧基和乙醇中乙氧基换位，生成单或双乙氧基衍生物，为了避免这些杂质的生成。可以用KOH代替NaOH和甲醇皂化，但也必须加入焦性没石子酸，否则辅酶Q10在皂化过程中全部被破坏，加入量占起始原料的5%-7%，皂化过程中可以通入氮气。醇一醚混合提取法，该工艺与醇一碱皂化制造法工艺相似，只是省去了皂化反应。生物提取法是世界上最古老最基本的生产工艺，一段时间以来曾经是辅酶Q10唯一的生产方法。但由于动植物中辅酶Q10含量低、各种化学成分复杂，原料来源受限制（主要从动物新鲜肝脏中提取），因此产品成本高、价格昂贵，规模化生产受到了一定的限制。细胞培养法

植物细胞培养技术是将植物体的某一部分经过无菌处理后，置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。植物的各个部位，如根、茎、叶、花、果、花药和花粉等都可以作为外植体来启动细胞培养，所形成的脱分化细胞团称为愈伤组织，将愈伤组织转移到液体培养基中进行培养称为悬浮培养。

生物提取法

1977年实现了重组微生物发酵法生产辅酶Q10。这种生产工艺被认为是最有前途的合成工艺，近几年来微生物发酵法成为国内外开发的热点。红极毛杆菌、脱氮极毛杆菌，甲烷微环菌等是生产辅酶Q10的主要菌种。

发酵法

由于辅酶Q10是微生物发酵所得的细胞内产物,故其提取过程中首先需要进行细胞破壁,因此细胞破碎是提取辅酶Q10的关键步骤之一,直接影响着辅酶Q10的生物活性、收率和成本。

1.皂化提取法皂化提取法是将辅酶Q10提取物中含有的大量脂肪酸甘油酯及各种游离脂肪酸等非水溶性组分转移到水相，而脂溶性的辅酶Q10则留在有机相，再使用有机溶剂抽提，从而提高其纯度和提取量。常见的皂化提取法主要有醇碱皂化提取法和碱皂化提取法。（1）醇碱皂化提取法醇碱皂化提取法的一般方法为：首先向菌体中加入质量分数为7%左右的焦性没食子酸，再缓慢加入1.3~1.5倍提及的氢氧化钠-乙醇溶液搅拌，再加入正己烷进行回流提取，迅速冷却至室温。然后用适量石油醚多次萃取，水洗至中性，再取水浓缩，真空弄碎旋转蒸发除去有机溶剂，最后用无水乙醇溶解。醇碱皂化法中，由于乙醇的存在下，长时间的皂化可能导致辅酶Q10中甲氧与乙醇中乙氧基换位，生成单或双乙氧基衍生物。辅酶Q10的提取（2）碱皂化提取法碱皂化提取法的一般方法为：首先向菌体中加入酸性水，水浴加热回流3h后，缓慢加入稀释一定倍数的氢氧化钠，再回流一段时间，迅速冷却至室温。然后加入用有机溶剂浸提2~3次，取上清液水洗至中性，再取水浓缩，真空浓缩旋转蒸发除去有机溶剂，最后用无水乙醇溶解。

常见的细胞破碎方法有：有机溶剂搅拌、研磨、超声波、溶菌酶酶解辅助超声冻融辅助超声法等破碎方法。

生物制药工艺课程维生素C的发酵制药

又名抗坏血酸（Ascorbicacid）是细胞氧化-还原反应中的催化剂，它释放两个氢原子后变成氧化型维生素C，有供氢体存在时，脱氢抗坏血酸可以接受两个氢原子变成抗坏血酸，参与机体新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。用于防止坏血酸和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合，以及用作辅助药物治疗。维生素C

维生素C(多羟基不饱和内酯衍生物)分子中有两个手性碳原子，故有4种光学异构体，其中L（+）抗坏血酸效果最好，其他三种临床效果很低或无效。1.化学结构

白色粉末，无臭、味酸、熔点190-192℃，易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种还原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在碱液中或有微量金属离子存在时，分解更快，但干燥结晶较稳定。2.性质（1）化学合成法莱氏法化学合成（2）发酵法一步发酵、二步发酵（3）生物提取法从鲜枣、猕猴桃水果中提取维生素C当前生产维生素C主要采用的是微生物发酵法。3.维生素C的生产方法（1）莱氏法化学合成工艺1）工艺路线[转化]

[酸化]HCl[氧化]NaOH,O2,KMnO4

[酮化]H2SO4丙酮[加氢]H2D-葡萄糖D-山梨醇双丙酮-L-山梨糖维生素CL-山梨糖[酶菌氧化]O2双丙酮-L-古龙酸2-酮-L-古龙酸

①山梨醇发酵菌种醋酸菌属可使山梨醇氧化成山梨糖，一般用A.Suboxyclans和A.Melangenum。②发酵条件温度为26-30℃，最适pH为4.4-6.8。pH4.0以下菌的活性受影响。用0.5%酵母浸膏为主要营养源，山梨醇浓度为19.8%，通气量1800ml/min，30℃培养33h，山梨糖收率可达97.6%。氮源：无机氮源不能利用，使用有机氮源。金属离子的影响：Ni2+、Cu2+能阻止菌的发育，铁能妨碍发酵，为了使发酵顺利进行，需用阳离子交换树脂将山梨醇中的金属离子去掉。2）工艺过程

整个合成过程中必须保持第4位碳原子的构型不变；维生素C的总收率约60%。

C-4内酯化、C-2烯醇化：酸转化：配料比2-酮基-L-古龙酸：38%盐酸：丙酮=1：0.4：0.3（质量/体积）碱转化：先形成2-酮基-L-古龙酸甲酯，加NaHCO3转化生成维生素C钠盐，经氢型离子交换树脂酸化，在50-55℃下减压烘干，得粗品维生素C。(2)两步发酵工艺原理

两步发酵工艺流程2-酮-L-古龙酸[内酯化，烯醇化]

[生物转化]

假单孢菌D-山梨醇维生素C（L-抗坏血酸）L-山梨糖[氧化]

醋酸杆菌1）D-山梨醇的化学合成

50%葡萄糖溶液在75℃下加入活性炭，用石灰乳液调节pH8.4，加镍催化剂，通氢气，压力3.43MPa，反应温度140℃。反应结束后，静置沉降出去催化剂，反应液经离子交换树脂、活性炭处理后，减压浓缩，得到含量60-70%的D-山梨醇，无色透明或微黄色透明粘稠液体，收率约97%。2）2-酮-L-古龙酸的微生物发酵第一步发酵：黑醋酸杆菌（从D-山梨醇到L-山梨糖）第二步发酵：葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌混合培养发酵罐：气升式反应器，100立方米。3）2-酮-L-古龙酸的分离纯化发酵液中：2-酮-L-古龙酸8%，杂质有菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等。除杂操作：加热、离心。莱氏法是最早生产维生素C的方法,其以葡萄糖为原料,先经黑醋菌发酵生成L-山梨糖,再经丙酮化及NaClO氧化、水解得到2-酮-L古龙酸钠,然后进行化学合成得到维生素C。此法存在着很多缺陷,如生产工艺复杂、劳动强度大、生产环境恶劣、易对人体造成伤害,因此人们不断对此工艺进行改进。两步发酵工艺

发酵：此法省略了酮化和NaClO氧化过程,简化了工艺，极大地改善了操作环境。除主耗山梨醇消耗较高外，其他辅料消耗较低。且多为液体反应，物料输送方便，更有利于生产连续化和操作自动化。但此法仍存在很多缺点，如占地面积大、发酵基质浓度低、在高湿高温条件下染菌机率高、设备利用率低、后续处理能耗高等问题。在未来的工艺优化过程中，除了进行发酵工艺改进外,更应注重优良菌种的选育。发酵液的提取工艺是维生素C生产行业中较为重视的问题。经过两次发酵后,发酵液的含量仅为6%～9%，且残留有菌丝体、蛋白质和悬浮微粒等，分离提纯较为困难。传统的处理方法有加热沉淀法和化学凝聚法。针对以上两种方法中存在的缺点和不足，一种新的处理方法———超滤法在维生素生产中得以应用。此法具有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优点。此法与加热沉淀法相比，可在常温下操作，减少了有效成分的损失;且为后步树脂交换提供了有利的条件,减少了树脂的污染，从而有利于提高树脂的