单宁酶开题报告

篇一：单宁酶摘要单宁酶是一种水解酶，能水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚酸键，生成没食子酸和其他化合物。在酶制剂工业发达的国家，如日本、美国，单宁酶的基础理论和应用研究工作开展得较早，并已在茶饮业中获得了很好的经济效益。伴随国民经济的不停发展，人们生活水平的不停提高，单宁酶得到了更广泛的应用。人们已在皮革业、饲料业、化妆品业等方面开发了单宁酶的多种用途。中国是个茶叶大国，并且可开发资源丰富，单宁酶的应用前景十分广阔。单宁酶的性质国外对单宁酶性质的研究相对较多，也较深入，为此后的应用研究提供了有价值的参照。单宁酶的酶学性质来源于不一样菌种的单宁酶动力学性质稍有区别。yamadah.等报道的黄曲霉单宁酶活性稳定ph值范围最窄，为5.0～5.5另据韩国的chaesoo-kyu等报道的曲霉菌种an-11单宁酶活性稳定的ph值为5.0～6.5其他菌种单宁酶活性稳定ph范围大都在3.0～8.0之间，最适ph值为4～6，热稳定范围在70～80℃如下，最适反应温度为35～60℃。日本科学家hdeaki4yamada等就底物浓度对黄曲霉的影响进行了研究，测出km(以单宁为底物)为0.5×104mol/l;km(以葡萄糖212没食子酸为底物)为1.4×10mol/l；km(以没食子酸甲酯为底物)4为8.6×10mol/l。经6mol/l盐酸胍处理后，单宁酶将发生不可逆失活，多种金属离子以及edta对酶活性影响报道结论不一。单宁酶的物理化学性质纯单宁酶在紫外光区280nm处，有一种最大吸取峰，在浓度为10%，比色皿为1cm×1cm条件下，吸光系数a为11.8，260nm处吸光度与280nm处吸光度之比为0.51。sadaakiiibuchi，chaesoo-kyu分别用凝胶过滤法测定出它们各自选育的菌种单宁酶相对分子质量都为200000。osaoadachi等分别用沉降法和电泳法测定黄曲霉单宁酶相对分子质量，分别是194000和192000。chantal等测出黑曲霉lcf8单宁酶相对分子质量为186000，其等电点在4左右。chantal和chaesoo-kyu在对各自提纯的酶进行sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时发现，单宁酶分子由2种亚基构成，但这个成果与kengiaoki对酵母单宁酶构造分析的成果有所不一样。后者用同样的措施，只好到一条电泳蛋白带。saoadachi等深入研究了黄曲霉单宁酶的其他构造特性，其分子中氮含量为12.9%(凯氏定氮法)，用二硝基氟苯法测氨基末端，有2个dnp-氨基酸产物，分别为dnp-丙氨酸与dnp-精氨酸,这一成果深入指明黄曲霉单宁酶为2种亚基构成。单宁酶另一重要特性是，它为一种糖蛋白，而不一样来源的单宁酶糖含量有差异。例如，黄曲霉单宁酶糖基占总相对分子质量的25%，糖基为甘露糖。chantal从黑曲霉中提取的单宁酶，其糖基含量高达43%，而酵母单宁酶糖基含量为62%。parthasarathyn.等探明其选育的黑曲霉单宁酶碳水化合物为葡萄糖和甘露糖，肽链通过丝氨酸和苏氨酸与糖基相连接。糖基与酶的功能关系尚未见报道。单宁酶的催化性质saddakiiibuchi等对米曲霉单宁酶的催化途径、底物的专一性和阻遏作用进行了研究。成果表明，单宁酶催化葡萄糖酸酯，水解成没食子酸与葡萄糖。中间产物为1，2，3，4，6-黄酰单宁和2，3,4，6-四酰单宁以及两种没食子酸葡萄糖。反应途径如下所示：单宁酶只能水解没食子酸化合物中的酯键，不对底物类似物如甲基间二羟甲酸盐起作用。酶对底物与否有催化作用决定于es复合物的形成。es复合物形成条件有3点：a.只要是没食子酸形成的酯,对醇没有限制；b.酚羟基在苯环上相对位置不一样，将影响其与酶的结合作用；c.形成的es复合物中酚羟基形成的酯键可被水解，而其他酯键或羧基由于没有直接与酶结合，不能发生以上的反应。酶反应受到含酚羧基的底物类似物的竞争性克制，但2,6--二羟基苯甲酸是非竞争性克制。这表明尽管底物与酶结合的复合物都是没食子酸化合物，但因酶与底物结合位点不一样，它对某些酚羟基底物起作用，而对另某些底物类似物又不起作用。单宁酶的来源单宁酶重要来源于微生物，菌种重要为曲霉菌。此外，青霉、酵母、细菌、植物也有产单宁酶的报道，国外资料报道的多种产酶菌种列于表1.这些菌种都是以单宁作为诱导物来产生单宁酶的，充足证明单宁酶为一种诱导酶。doiseniji等从基因体现调控方面对菌种产生单宁酶进行了探索,证明指导单宁酶生物合成的mrna极不稳定,而放线菌酮可迅速制止单宁酶的产生。单宁酶的提取与纯化单宁酶的提纯技术伴随蛋白质提纯技术的进步而不停提高。在分离纯化此酶的过程中，重要困难表目前破壁取酶。曲霉单宁酶为胞内酶，它分布于真菌的细胞壁与细胞膜之间，结合得非常牢固，可以认为是固定在细胞中。要充足提取酶，首先面临的是怎样有效地破壁，使酶最大程度地释放出来。运用超声波、石英砂研磨、渗透法等经典措施破壁时，酶得率较低。法国科学家运用冻融法，再加入伴刀豆球蛋白(凝集素)破壁，此法是在菌种产酶高峰过后，待胞壁韧性减少时采用的，酶得率虽较第一类措施有所提高，但损失仍然严重。翌年，他们将生产几丁质酶的链霉素菌丝体与产单宁酶菌种保温培养一段时间后，53%的胞内酶得以释放。在此之前，也有有关几丁质酶、α-葡聚糖酶或β-葡聚糖酶破壁的报道。酶法破壁大大提高了酶得率，但也不可防止地给后期提纯工作带来了麻烦。单宁酶的分离提纯手段大体可以归纳为如下几条路线：硫酸铵沉淀a、细胞破壁（物理措施）→利凡诺（乳酸-6，9-二氨基-7-氧基吖啶）沉淀→丙酮沉淀阴离子互换柱→葡聚糖凝胶过滤b、细胞破碎（物理措施）→超滤（200000）→超滤（100000）→proteinpaksw300c、细胞破壁→聚合物沉淀→透析d、细胞破壁（几丁质酶等）→反向胶束系统。上述几条路线表明：为适应单宁酶商品化需求，单宁酶的提纯技术在从复杂且成本高的试验室提纯手段向简要的工业化生产过渡。chantal报道的反向胶束系统可有效地提高酶产量，大大地缩短纯化过程。反向胶束系统是80年代初期兴起的一项蛋白质提纯技术，它的基本原理是运用表面活性剂在有机溶剂中形成一种个胶团，极性基团向内排列，而形成极性区域，胶团内部能为酶提供最佳微环境，在热力学上稳定且表面活性剂的性质和水含量最佳化时，反向胶束系统中的酶稳定性可大大提高。酶分子可容纳于此，这样酶分子就可与其他杂质分开。与其他提纯手段相比，反向胶束系统更适于工业化生产。单宁酶活力测定措施单宁酶活力测定措施有滴定法、紫外分光光度法、比色法以及高效液相色谱法,多种措施基本原理简述如下.滴定法由于单宁在单宁酶作用下分解生成游离的没食子酸，可用碱对之进行滴定，确定底物单宁的减少许而测得酶活力。不过，由于缓冲液对碱的缓冲力以及单宁自身的褐色干扰了滴定终点，再者，随溶液ph值增高，单宁会逐渐发生水解，将影响测定成果的稳定性与精确性。紫外分光光度法日本sadaakiiibuchi等于1967年建立了紫外分光光度法，基本原理是通过测定底物单宁反应前后在紫外光区310nm处光密度的变化，求得单宁酶活力。这个措施成为后来单宁酶活力测定的经典措施。此法简朴快捷，且误差在1%～3%之间，但底物单宁纯度规定非常高。1995年,sadaakiiibuchi建立的紫外分光光度法基础上，改建了单宁酶活力测定措施，以没食子酸丙酯(pg)为底物，在270nm处,pg浓度在一定范围内与吸光度成正比，根据此原理建立的酶活力测定措施，简便敏捷，反复性好。视读法1993年，澳大利亚科学家osawer.等建立了细菌单宁酶活力测定措施，其根据有两点：a.单宁可水解生成游离的没食子酸；b.没食子酸在空气中暴露被氧化，颜色从绿色变成褐色。通过比色求其变化量而测得酶活力。高效液相色谱法1994年,法国的chantalbarthomeuf等用高效液相色谱法持续测定反应过程中产物没食子酸变化量，直接测定出酶反应的初速度，此法迅速精确，但对仪器规定较高。篇二：单宁酶单宁酶及其在茶饮料中的应用【摘要】单宁酶可水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，重要由曲霉属等微生物发酵生产。单宁酶防止冷混浊、提高提取率、保持色泽和减轻苦涩味的作用在茶饮料工业中有广泛的应用。【关键词】单宁酶；茶饮料；应用单宁酶又称单宁酯酰水解酶（ec3.1.1.20），它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，可广泛应用于制革、酿酒、医药、饮料等领域。1单宁酶的性质和生产1单宁酶的来源和性质单宁酶除存在于富含单宁的植物中外，还广泛存在于微生物中。可以产生单宁酶的微生物来源十分丰富，重要是真菌类的曲霉属、青霉属和根霉属，尤其是曲霉属中的黑曲霉、米曲霉和黄曲霉；此外，酵母菌、寄生内座壳菌、巴斯德菌、茄形镰刀菌和绿色木霉等也可产生单宁酶。单宁酶是一种糖蛋白，不一样来源的单宁酶其分子量和糖链的含量有所差异，酶蛋白由2-8个单体聚合而成，糖基含量由12%到62%不等。不一样来源的单宁酶温度和ph稳定性不一样：最适温度较高的50-60℃，一般在30-40℃之间，热稳定范围在60-70℃如下；来源于真菌和植物的单宁酶的最适ph一般为4.0-6.0，ph稳定性范围一般是3.0-7.0之间，细菌单宁酶的最适ph一般偏中性[2]。金属离子对单宁酶活性的影响也有所不一样：libuchis等[3]发现许多离子对单宁酶无活化作用，但zn2+和ca2+可克制酶活，此外edta溶液会使酶完全失活，而aokik[4]等发现edta对酶活无明显影响。rajakumargs等[5]发现cu2+，zn2+，fe2+，mg2+均对酶活力有明显影响。郭鲁宏等[6]研究发现除了mn2+，zn2+克制酶活之外，其他金属离子对酶活均无明显的激活或克制作用。karb等[7][41]研究表明mg2+、hg+可提高单宁酶活力，ba2+、ca2+、zn、hg、ag会克制酶活力，fe、co完全克制酶活。2单宁酶的发酵生产单宁酶是一种诱导酶，可由微生物在单宁酸存在的条件下诱导产生的，目前对单宁酶发酵生产研究的重点多集中在曲霉和青霉上，常通过诱变育种选育和改良生产菌株以及通过优2+++3+2+化发酵条件等途径来提高发酵产酶活力。如libuchi等[1]以asporyzae为出发菌株，以单宁酶为诱导物，探讨了菌株产单宁酶的最适培养条件。aokik等[4]以酵母属的candidaspk-ⅰ为出发菌株，以单宁为诱导物，探讨了培养的最适条件，发现添加了3%的单宁所得的单宁酶积累量最多。bradoos等[8]对产单宁酶的日本曲霉进行摇瓶发酵培养条件优化，将酶活力提高了13%。龚加顺等[9]运用离子注入技术诱导得到一株单宁酶高产的9701菌株，其摇瓶培养的酶活力高达13.0liu/ml，比出发菌株9401的酶活力高了2.89倍，且产酶性能稳定，反复性好；对另一株单宁酶高产菌株进行产酶条件优化后，获得了53.58mo1/s的高产酶活力。王征等[10]对黑曲霉的产酶发酵条件进行优化研究，获得316u/m1的较高酶活力。刘如石等[11]对黑曲霉no.3菌株产酶发酵条件进行优化研究，最高酶活力可达144.25u/100ml发酵液，酶比活力为17.71。近期余钧池等[12]采用先培养菌体后再诱导产酶的方式，在诱导剂浓度为1.5%，诱导培养基初始ph5.0，30℃培养48h的条件下，发酵米曲霉得到的单宁酶活力相称于167.4u/ml发酵液。基因工程育种具有能定向、稳定遗传、目的性强、育种周期短和能克服远缘杂交的障碍等长处，国内外都开展了构建高产单宁酶基因工程菌的研究。hatamotoo等[13]克隆了米曲霉单宁酶的基因，用3个脱氧核糖核苷酸探针按照单宁酶n-末端和内在的氨基酸序列合成了单宁酶基因。单宁酶低产菌株米曲霉ao1被包括单宁酶基因的质粒pt1转化后，转化株的单宁酶活力增长了，且与转化的质粒数成比例。陈志仕克隆并分析了米曲霉单宁酶基因序列，构建了含单宁酶基因的载体，实现了在大肠杆菌（e.coli）和毕赤酵母（pichiapastoris）中的体现。郑穗兰[15]改造了重组米曲霉单宁酶基因的体现质粒，成功地进行了基因体现框架的改造，通过转化筛选获得了转化子并进行了摇瓶体现的初步探索。zhongxf等[16]研究了米曲霉单宁酶基因在毕赤酵母（pichiapastoris）中的体现，酶活力比出发菌株提高了3倍。由于天然菌生产单宁酶重要是通过曲霉属微生物的发酵获得，曲霉属发酵工艺成熟、易于大规模的培养、成本低廉、副产物少、产物分离简朴，人们也对运用重组曲霉体现系统提高单宁酶的体现进行了尝试。如黄小凤等运用pcr扩增得到米曲霉单宁酶基因的编码序列，然后将其连接到黑曲霉的体现载体aned2-sp2上。将构建好的单宁酶基因体现载体通过原生质转化法导入黑曲霉菌株st31中，该重组菌株的单宁酶活力最高为104.02u/ml，比原始天然菌株提高了2-3倍。tadashit等价值。单宁酶的生产可采用固体发酵和液体深层发酵两种措施。虽然固体发酵的设备规定比较简朴，易于推广，但其缺陷是轻易污染杂菌；而液体深层发酵比较轻易控制，不易污染杂菌，并且生产效率高，目前单宁酶的研究和生产多采用液体深层发酵的措施。[18][17][14]将外源的dna整合到大豆曲霉和米曲霉的染色体中，提高了在ku70和ku80基因断裂过程中基因的中靶频率，为单宁酶基因的整合提供了参照2单宁酶在茶饮料中的应用1防止茶饮料的冷浑浊在茶饮料的生产中，茶叶的高温提取液冷却后会变浑浊，并产生絮状沉淀（茶乳酪）。茶叶提取液中固形物浓度越高，这种沉淀现象越严重，影响了茶饮料的稳定。此外，茶饮料在冷藏中也会变得浑浊，滋味和香气都会产生很大的影响，这种现象使其作为冷饮的商品价值受到很大的损害。茶饮料产生茶乳酪沉淀的原因是茶水中的咖啡因与儿茶素或者是以茶黄素等为关键形成的不溶性复合物，防止产生沉淀的措施包括原料茶叶的选择、合适的抽提条件、膜过滤处理、减少水溶性固形物的浓度等，也有采用添加pvpp进行处理。但不管是哪一种措施都会使茶叶的特有成分咖啡因和儿茶素类的含量下降，添加糖类虽然可克制沉淀生成，但也存在增长热量等问题。单宁酶是将茶乳酪转溶的专一酶，它能断裂儿茶酚与没食子酸间的酯键，使苦涩味的酯型儿茶素水解，释放出的没食子酸阴离子又能与茶黄素、茶红素竞争咖啡碱，形成分子量较小的水溶性短链物质，从而减少茶汤的混浊度[20]。takinoy[21]运用米曲霉产生的单宁酶作用于6%的红茶茶汤，发现单宁酶在茶汤ph为5.6，温度为45℃的条件下作用30-60分钟后，茶乳酪产生至少。可口可乐企业运用单宁酶处理茶饮料中的“冷后浑”，获得了良好的效果，浑浊度由80%降至8%[22]。对红茶进行单宁酶处理，成果发现速溶茶完全溶于冷水，并且滋味良好，而无酶处理的茶的固形物和浸提物产量均低于酶处理的茶[23]。日本专利jp3951260报道：将提取物的温度控制在单宁酶合适温度（20-80℃），添加酶量为每克干茶0.5～50单位，调整ph4.0～7.0，经酶处理的茶汤用分子量不少于5000道尔顿的超滤膜过滤，再经反渗透浓缩后，冷冻干燥即得冷水可溶的速溶茶[24]。近年来由于透明塑料瓶的大量使用，饮料的透明度比以往有更高的规定，单宁酶防止茶饮料产生冷浑浊的作用效果愈加受到关注。2提高茶叶的提取率3保持茶汁的色泽和减轻苦涩味一般茶饮料由于浸出后产生沉淀，就会使提取液中的固形物浓度下,降而色泽变淡。单宁酶的作用提高了茶成分的得率，就能防止这种现象的发生。同步，由于茶叶中所含的咖啡因、维生素、儿茶素类物质具有多种生理功能，例如茶多酚类的抗氧化作用、抗菌作用等，通过单宁酶处理，提高茶叶有效成分的得率，也就提高了其功能性。美国斯福冰茶企业研究认为，在加工速溶红茶的提取工序之前，将红茶先用单宁酶和纤维素酶的溶液喷洒，然后将茶叶放入封闭系统中放置一段时间，不仅可提高原料的制取率，增长可溶性物质的含量，并且还能减轻某些苦涩味，增长茶叶的香气。在绿茶、乌龙茶加工中的应用研究中也发现，加入一定量的单宁酶能减少酯型儿茶素的含量，从而消除夏秋茶的部分苦涩味道[22]。3展望单宁酶防止冷混浊、提高提取率、保持色泽和改善口味的作用在茶饮料工业中有广泛的应用。怎样采用更高效的措施培育高产菌株、提取单宁酶液，以减少成本，是单宁酶研究中的重要内容。此外，单宁酶假如是以水溶性酶的状态进行作用，酶在整个反应系统中与底物、产物混在一起，难以回收运用。寻找合适的载体，将酶固定化，实现酶反应工艺管道化、持续化、自动化，将深入减少生产成本，提高生产效率。参照文献[1]libuchis,minoday,yamadak.studiesontanninaeylhydrolaseofmieroorganismspartⅱ.anewmethoddeterminingtheenzymeactivityusingthechangeofultravioletabsorption.agl.biol.chem,1967,31(5):513-518[2]苏二正,夏涛,张正竹.单宁酶的研究进展.茶业通报,,26(1):16-19[3]libuchis,minoday,yamadak.studiesontanninaeylhydrolaseofmieroorganismspartⅲ.purificationoftheenzymeandsomepropertiesofit.agl.biol.chem.,1968,32(7):803-809[4]aokik,shinker,nishirah.purificationandsomepropertiesofyeasttannase.agr.biol.chem,1976,40(l):79-85[5]rajakumargs,nandysc.isolation,purification,andsomepropertiesofpenieilliumchrysogenumtannase.appliedandenvironmentalmicrobiology,1983,46(2):525-527[6]郭鲁宏,杨顺楷,曾仲奎.黑曲霉单宁酶的纯化及部分性质研究.四川大学学报(自然科学版),1999,36(3):578-582[7]karb,banerjeer.effectofadditivesonthebehaviouralpropertiesoftanninacylhydrolase.procbiochem,,38(9):1285-1293[8]bradoos,guptar,saxenark.parametricoptimizationandbiochemicalregulationofextracellulartannasefromaspergillusjaponieus.proeessbioehemistry,1997,32(2):135-139[9]龚加顺,肖琳,姚建铭.单宁酶高产菌株发酵条件研究.西南农业大学学报,1999,21(5):234-634[10]王征,谢达平.黑曲霉产单宁酶发酵条件优化研究.湖南农业科学学报,1998,24(5):380-383[11]刘如石,李清明,谢达平等.asp.nigerno.3液态发酵生产单宁酶条件的研究.食品科学,,22(2):28-32[12]余钧池,谢庆武.米曲霉单宁酶产酶条件及其应用的研究.广西轻工业,,(7):12-23[13]hatamotoo,watarait.cloningandsequencingofthegeneencodingtannaseandastructura