医学遗传学试验讲义

医学遗传学实验讲义浙江大学医学院

医学遗传学课程组

2012年9月3日#班级 姓名 标本编号：分析结果：TOC\o"1-5"\h\z1 2 3 4 5—————A———— ———B——6 7 8 9 10 11 12———————————C—————————————13 14 15 16 17 18 19 20————D——— ———E———— ——F—21 22—G— 性染色体实验三人类染色体G带标本制备及观察一、实验目的通过实验掌握G带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G带分裂相。二、实验原理有许多显示G带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa染色。通过胰酶处理使G带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态，由此可见在G带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。Giemsa染料是由天青和伊红组成的，染色首先取决于二个天青分子同DNA结合，在此基础上结合一个伊红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。三、实验准备实验材料常规的人类体外周血染色体制片。实验器材恒温水浴箱、烧杯、染缸、显微镜附油镜头、香柏油、擦镜纸、恒温培养箱、镊子、记号笔或铅笔等。药品和试剂1.Hanks液NaCI 2.0gKCI 0.1gNa2HPO4.12H2O 0.0375gK2HPO4 0.015g葡萄糖 0.25g加双蒸水250ml及1%酚红0.5ml，成Hanks液。2．胰酶液称取胰酶0.2g溶于100mlHanks液中，搅拌半小时，用1NNaOH调pH7.0〜7.2，冷冻保存。（最好现配现用）3．磷酸缓冲液（pH6.8）4.Giemsa染液5．生理盐水四、实验步骤.先将胰酶液水浴加热到37℃。.将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间几秒到几十秒不等，依样本存放时间长短而定。（标本需预先经60〜70℃烤2小时，或37℃恒温老化5〜7天。标本太新鲜，染色体有些毛）.取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再经过蒸馏水洗。.Giemsa染液染色8分钟。.自来水洗、晾干。.镜检。选择分散及显带良好的分裂相，在油镜下观察。如观察到染色体变粗并显得毛糙边缘，有时甚至呈糊状，是处理过度了。观察细胞的标准：细胞完整，轮廓清晰，染色体在同一平面上均匀分布。染色体形态和分散良好，最好无重叠现象，即使染色体个别重叠，也要能明显辨别。所观察的染色体长短大致一样，处于同一有丝分裂时期。在所观察的染色体周围没有多个或单个散在的染色体。五、注意事项1．带效果的好坏，主要决定于染色体的标本质量。标本染色体要长，染色体分散合适，背景无胞浆，标本未老化即保存时间过长。2．要注意胰酶处理的温度和时间，稳定显带的条件，才能保证显带效果。.磷酸缓冲液的pH值不要过碱，偏酸为宜，否则着色不鲜明。.G带制备有许多种方法，各个实验室在细节处理上均不同，最好总结出适合自己实验室采用的方法。如果使用效果良好，不要轻易更换新方法。六、作业画出显微镜下你所观察的分裂相，要求标明染色体号数，请实验指导老师复核。实验四 Duchenne型肌营养不良症(口乂口)基因检测一、实验目的掌握Duchenne型肌营养不良症基因(DMD)检测的简便方法。二、实验原理1985年，KaryMullis创建了聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术，简称PCR技术。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低等特点。PCR反应是由变性(denaturation)、模板与引物结合(复性annealing)及延伸(extension)m个步骤为一个周期的不断重复过程，经过25〜30次循环之后，理论上可扩增109倍。PCR反应中通常只有一对寡核苷酸引物，而多重PCR(multiplexPCR)则是用几对引物在同一个PCR反应体系中进行扩增，这样可以同时扩增出几个不同专一靶区域的片段。Duchenne型肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)是一原发于肌肉组织的遗传病，特点是进行性加重的肌肉萎缩和无力，临床表现腿的假性肥大，血清酶学明显升高。本病呈X连锁隐性遗传，一般男性儿童发病。DMD基因定位于Xq21.2-21.3之间，全长2300kb左右，由79个外显子组成，编码含3685个氨基酸的蛋白质一抗肌营养不良蛋白(dystrophin),这种蛋白具有稳定细胞膜和细胞内钙调节的功能。DMD基因有多种突变形式，60%是外显子缺失突变，5%是重复突变，35%可能是很小的DNA片段缺失或点突变。通常选择DMD基因中9个缺失热点的外显子扩增，可检出缺失突变中的90%。为节省经费，本实验设计为扩增DMD基因中4个外显子，其中外显子45和48在中国患者中的检出率分别为26%和48%。DMD基因4个外显子的引物顺序外显子PCR产物大小 引物F引物R8360gtcctttacacactttacctgttgagggcctcattctcatgttctaattag19459ttctaccacatcccattttcttccagatggcaaaagtgttgagaaaaagtc45547aaacatggaacatccttgtggggaccattcctattagatctgtcgccctac48506ttgaatacattggttaaatcccaacatgcctgaataaagtcttccttaccacac三、实验准备实验材料正常对照DNA样本、DMD患者DNA样本。基因组DNA稀释至100ng/^l,备用。实验器材微量加样器、枪头(10Rl,100Rl)、Eppendorf管、PCR仪、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射反射仪。药品和试剂PCR试剂盒、dNTPs、PrimerR+F混合液：包括外显子8、19、45和48,终浓度各25pmol/山、石蜡油、琼脂糖、6x载样缓冲液、溴化乙锭、pUC19/MspI、1xTBE电泳缓冲液。四、实验步骤.正常对照DNA样本、DMD患者DNA样本分别进行PCR扩增。PCR操作如下：每一个薄壁离心管中加入：(反应总体积为25|il)双蒸水 17.5Rl10xBuffer 2.5rlMgCl2 2RldNTPs 0.5RlPrimerR+F（混合） 2|ilDNA模板 0.5pilTaq-DNA聚合酶 0.3pil石蜡油 1滴放置在PCR循环仪上，循环参数设置为：Step1（1个循环）94℃5分钟Step2（30个循环）94℃30秒T56℃30秒L72℃30秒Step3（1个循环）72℃7分钟.PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。（1）配制2%的琼脂糖凝胶配制1XTBE电泳缓冲液70ml于三角烧瓶中，称取1.4g的琼脂糖粉放入后，沸水锅或微波炉内加热熔化,冷却至60℃,加入溴化乙锭至终浓度为0.5口g/ml,混匀凝胶，倒入电泳槽中，插入梳子，待凝固。（2）向电泳槽中倒入1XTBE,其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。（3）取PCR扩增样品103加入3四l的6x载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。（4）接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负极）。电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）。140V,电泳2小时左右。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。（5）卸下凝胶，紫外仪上观察电泳条带，并与核酸分子量标准MarkerpUC19/MspI比较，判断扩增产物的有无及片段大小。五、实验结果可以观察到正常对照样本有4条带，从负极往正极分别为外显子45、48、19和8。DMD患者缺失不同的外显子，如有缺失需3次以上的重复实验来证实泳道1、2、5、7和8是正常对照；泳道3、4和9是第19外显子缺失的患者；泳道6是外显子48缺失的患者;泳道10和11是外显子45缺失的患者。M：pUC19/MspI。六、注意事项.引物设计时长度15~30个碱基为宜，G+C含量一般为40%~60%。.退火温度决定PCR反应的特异性，退火温度高，PCR反应的特异性好；温度低，有时会有非特异性条带。.Mg2+浓度对扩增产物的特异性及产量有显著影响，Mg2+浓度低，扩增产物的特异性好，但有时产量低；Mg2+浓度高，扩增产物的特异性差，有非特异性条带。.PCR循环的次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上25~30次循环后PCR产物积累即可达到最大值。在满足产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。实验五遗传病基因突变分析一、实验目的通过实验掌握DNA的提取、聚合酶链反应（PCR）以及DNA单链构象多态性分析（SSCP）等几种分子生物学实验方法，并了解SSCP分析法是检测基因突变的一种基本方法。二、实验原理.DNA抽提核基因DNA可以从任何有核细胞中提出，人外周静脉血的淋巴细胞是抽提核基因DNA最方便的材料。EDTA抗凝的外周静脉血经离心处理后，可分离得到大量淋巴细胞的细胞核。由于DNA在细胞核内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取过程中必须将其中的蛋白质除去，蛋白酶K可用于消化细胞核膜及核内蛋白质，消化的蛋白质用饱和NaCl沉淀，核DNA最后用酒精析出。.聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下TaqDNA聚合酶催化引物延伸。以上三步为一个循环，循环25〜35次，模板DNA可扩增100万倍左右，整个反应在2〜3小时内完成（见图）。

+第1轮循环至击轮循环L—[I]]IHTT+第1轮循环至击轮循环L—[I]]IHTT=变性和引物复性弓I物延伸变性和引物复性引物延帕变性和引物复性引物延伸PC版应原理示起图.单链构象多态性分析单链构象多态性(singleStrandConformationPolymorphism,SSCP)分析法是一种DNA单链凝胶电泳技术，该法具有快速、简便、灵敏和适用于大样本筛查的特点，可有效检出碱基置换、缺失、插入等基因变异。目前，已广泛用于癌基因、遗传病基因诊断等领域。SSCP原理是在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同。PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段有基因突变存在(见图)。对于小于300bp单链DNA片段，SSCP分析的检测灵敏度可达90%~99%。随着DNA长度增加，其检测灵敏度相对减弱。野牛型野牛型DNA突变DMAvrtwtm不止膝CP原理示意图（一条染色体）Wt：野生型R：突变型三、实验准备实验材料人外周静脉血实验器材吸管、Eppendorf管、薄壁离心管、PCR仪、高速台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外透射反射仪、注射器（2ml）、针头、10ml玻璃离心管、10ml塑料离心管、各种微量加样器、枪头（103、1003、1000口1）、天平、各种试管架、烧杯、石蜡膜、量筒、恒温水浴箱、记号笔、不锈钢烧锅、高压灭菌锅、搪瓷盘、玻璃纸、电磁炉等。药品和试剂1.用于DNA提取药品和试剂10mg/m1蛋白酶K（-20℃冰箱保存）0.5MEDTA（pH8.0,灭菌保存）TE缓冲液（pH8.0,灭菌保存）缓冲液A（bufferA）：蔗糖109.536g2MTris.HCI5mlTriton-X-10010ml2MMgCI22.5ml双蒸水加至1000mL过滤，4℃冰箱保存。2MTris.HCI（pH8.0） （灭菌保存）2MMgCI2（灭菌保存）5MNaCl（灭菌保存）10%SDS琼脂糖（进口分装）5xTBE

核溶解缓冲液(nucleilysisbuffer)TOC\o"1-5"\h\z{5MNaCl 40ml核溶解缓冲液(nucleilysisbuffer)0.5MEDTA (pH8.0) 2ml2MTris.HCl (pH8.0) 2.5ml双蒸水 455.5 ml高压灭菌保存蛋白酶K工作液 1份样本为2ml血10samples20samples10mg/ml蛋白酶K100Rl200Rl10%SDS100Rl200Rl0.4MEDTA5Rl10RlddH2O794Rl1590Rltotalvolume1000Rl2000RlRg/口lEB（溴乙锭）6x加样缓冲液.用于PCR反应10xBuffer、MgCl2、dNTPs、Taq-DNA聚合酶由所购试剂公司统一提供。DNA模板：正常对照来自实验者的血液样本，基因突变样本来自1例角膜营养不良症患者。扩增片段为角膜营养不良症基因BIGH3第11外显子，扩增产物长度为223bp。引物序列如下：PrimerF：CTCGTGGGAGTATAACCAGTPrimerR：TGGGCAGAAGCTCCACCCGG.用于SSCP双甲基丙烯酰胺（Bis）丙烯酰胺 （Acr）TEMED30%贮存液： 「Acr 29gBis 1gl溶于100ml灭菌双蒸水中10%APS（过硫酸胺） 临用时配1%HNO30.2%AgNO3显影液 「Na2C03 2.96gJ双蒸水加至100ml,临用时配，4℃冷藏。［甲醛 临用时加54Rl〔10%硫代硫酸钠 临用时加10Rl10%乙酸10%乙醇蔗糖载样缓冲液（loadingbuffer）「95%甲酰胺«20mMEDTA1溴酚蓝，少许二二甲苯氰，少许四、实验步骤DNA抽提(1)抽取人静脉血2ml,EDTA抗凝。(2)加bufferA至5ml刻度线，混匀后，冰箱中冷藏保存10分钟。7000rpm离心10分钟，弃去上清液。重复上述操作两次。(4)加核溶解缓冲液0.3ml,震荡20秒。(5)力口10%SDS0.02ml和蛋白酶K工作液0.05ml,混匀后，37°C恒温水浴箱中消化过夜。(6)消化结束后，加0.1ml饱和NaCl,剧烈震荡后，4000rpm离心30分钟。(7)将含有DNA的上清液吸入另一新玻璃离心管中。加两倍体积的95%酒精，缓慢晃动，DNA逐渐被析出来。然后将DNA移至装有100四lTE缓冲液的eppendorf管中。(8)冰箱中放置一天后测浓度。DNA稀释至100ng/|il备用。PCR操作每一个薄壁离心管中加入：(反应总体积为25皿)双蒸水 18.5310xBuffer 2.5口lMgCl2 23dNTPs 0.5口lPrimerR+F 0.7.lDNA模板 0.5口lTaq-DNA聚合酶 0.3口lTOC\o"1-5"\h\z石蜡油 1滴放置在PCR循环仪上，循环参数设置为：Step1 (1个循环) 94℃ 5分钟94。C 30秒Step2 (30个循环) 卜9°C 30秒-72。C 30秒Step3 (1个循环) 72℃ 5分钟用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的有无。配制2%的琼脂糖凝胶，33的6x载样缓冲液和53的PCR产物混合后加样。60V,电泳30分钟。在紫外灯下观察结果。SSCP实验步骤8%的聚丙烯酰胺凝胶10ml,包括:TOC\o"1-5"\h\z厂H2O 5.3 ml蔗糖 6%J30%聚丙烯酰胺2.7ml\o"CurrentDocument":5XTBE 2ml10%APS 50|il'--TEMED 5口l用夹子夹好后,静置1小时聚合。聚合过程中凝胶会收缩,所以静置一些时间,待凝胶聚合后,应在梳子上加少量双蒸水。DNA样品的处理与加样PCR产物与15日lloadingbuffer混合后，100℃沸水中加热变性8分钟，冰水浴中骤冷10分钟，然后马上加样。(4)在电泳槽中，以IxTBE作为电泳缓冲液，150伏电泳约2〜3小时。由PCR产物的长度来决定电泳时间的长短。(5)银染用银染的方法来检测DNA分子是一种灵敏而简单的手段。利用银离子可与核酸结合的特性，在甲醛作用下银离子还原为Ag,使凝胶中DNA条带显黑色。银染法具有需要样本量少，操作简便，且无同位素污染，结果可以永久保存的特点，是十分方便、敏感的方法。其操作过程如下：电泳完的聚丙烯酰胺凝胶用10%的酒精浸泡5分钟。弃酒精，加入1%HNC)33分钟，不停摇动。③弃HNO3液，用双蒸水清洗两次。加入AgNC>3染液，染色1。〜20分钟。⑤用双蒸水清洗一次。加入显影液，至清淅的DNA单链电泳条带出现为止。最好是先加入少量显影液预显影，弃预显影液后，第二次再加入显影液，显影至DNA条带出现为止。弃显影液，加入10%的乙酸定影5分钟。弃乙酸，在双蒸水中浸泡5分钟以上。用玻璃纸包胶、干燥，观察分析及记录。(8)结果分析正常人样品目的区带有3条：一条双链