药物的含量测定方法与验证

第四章药物的含量测定方法与验证

基本内容第一节滴定分析法第二节分光光度法第三节色谱法第四节药品分析方法验证第五节定量分析样品的前处理方法基本要求

一、掌握定量分析方法验证的效能指标。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。三、了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用。含量测定：

药物的含量测定系指运用化学、物理化学或生物学的方法测定药物中主要有效成分的含量。第一节容量分析法（一）容量分析法的特点：常用于测定高含量或中含量组分，原料药含量测定首选比较准确（相对误差＜0.2%）；操作简单、快速；仪器普通易得；（二）有关计算

1.滴定度（T）：每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg)2.滴定度的计算

aA（待测物）

+bB（滴定液）

cC+dD

ab

T/M

1·m

T=m×a/b×Mm：滴定液浓度(mol/L)M：被测物分子量3.百分含量的计算（1）直接滴定法设至终点时，消耗滴定液体积为Vml则药物实测质量为V·T浓度校正因子W：供试品取样量

（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法）

药物+A（定、过量）→················剩余的A+B→·······（回滴）······V

空白试验···········································V0光谱

光谱分析法

分光光度法

分类

紫外-可见分光光度法

红外分光光度法

原子吸收分光光度法

荧光分光光度法

火焰光度法第二节分光光度法

二、光谱分析法

（一）紫外-可见分光光度法

吸收光谱范围：紫外：200～400nm

可见：400～760nm灵敏度高，可达10-4g/ml-10-7g/ml1.特点准确度高，RSD（%）为2%-5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用广范2.朗伯-比耳定律A=ECL

吸收系数：摩尔吸收系数ε——研究分子结构百分吸收系数Ｅ——含量测定3.仪器的校正和检定

波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波长处测定Ｅ，应符合规定杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液，规定波长处测定透光率，应符合规定

4.对溶剂的要求:含杂原子的有机溶剂通常具有很强的末端吸收它们的使用范围均不能小于截止使用波长石英吸收池、空气为空白

λ(nm)溶剂+吸收池A220～240≤0.40241～250≤0.20251～300≤0.10300以上≤0.055.测定方法

要求供试品溶液的A应在0.3～0.7

1）对照品比较法：A供／A对＝C供／C对原料药：制剂：2）吸收系数法：注意：应>100应注意仪器的校正和检定：作为计算浓度的因数进行定量的方法，不是任何情况下都适用的，特别时单色光不纯的情况下，A会随仪器不同而变化，误差较大但若认定一台仪器，固定其工作状态和测定条件，则C和A间的关系在多数情况下仍符合Lambert－Beer定律

3）计算分光光度法：方法有多种，具体按每种药物规定的方法进行。如：VA的三点校正法4）比色法

加入显色剂后，按照对照品比较法测定影响显色因素很多，故需注意平行操作空白溶剂：溶剂+显色剂，同法处理

（二）荧光分析法

灵敏度高，可达10-10g/ml～

10-12g/ml

在低浓度进行测定，防止自熄灭作用1.特点用基准溶液代替对照液校正仪器灵敏度制备荧光衍生物，可提高灵敏度和选择性

干扰因素多，需做空白实验样品用量少，操作简单，应用范围较广

2.含量测定

原理：当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度R与该物质浓度C成正比

方法：对照品比较法计算：

第三节色谱法

根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法，是分离分析混合物的最有力手段。

按分离原理：吸附；分配；离子交换；空间排阻分类

按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC

特点：高灵敏度、高效能、高速度、应用广泛（一）HPLC法

1.对仪器一般要求

固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变其他均可适当改变色谱图20分钟内记录完毕

2.系统适用性试验

色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)2分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);应大于1.5重复性：对照液连续进样5次，峰面积RSD≤2.0％拖尾因子：T=W0.05h/2d1

应在0.95～1.05

流动相真空脱气机四元泵自动进样器柱温箱紫外检测器蒸发光散射检测器液质联用仪质谱检测器流动相：对于以C18为固定相的反相色谱系统，常用甲醇-水，间或加以乙腈、缓冲液等为流动相，有机溶剂比例通常不低于5％四元泵自动进样器色谱柱填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶检测器测定方法1)内标法加校正因子测定供试品中主成分含量峰面积含量对照液（R）：ARCR

内标液（S）：ASCS供试液（X）：AXCXf=————AS/CSAR/CRf=————A’S/C’SAx/CxCx=f·————

AxA’S/C’S2)外标法测定供试品中主成分含量对照液（R）：ARCR

供试液（X）：AXCX要求：进样量准确、操作条件稳定CXCRAXAR——＝——CX＝————CR·AXAR

（二）GC法1.对GC仪器一般要求

载气：氮气色谱柱：填充柱或毛细管柱填充柱：内径2～4mm，长1～10m，内装吸附剂高分子多孔小球或涂渍固定液的载体毛细管柱：内径0.2～0.5mm，长10～100m，一般为空心柱，内壁或载体经涂渍或交联固定液检测器：氢火焰离子化检测器色谱图：30分钟内记录完毕

2.色谱适用性实验：同HPLC

3.测定法：同HPLC

第四节药品分析方法验证

目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。

起草药品质量标准生产工艺变更制剂组分改变原分析方法修订验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性均需对分析方法进行验证一、准确度（accuracy）：测量值与真实值接近的程度表示:回收率测定方法：回收试验

加样回收试验含量测定方法的准确度

1.原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较

2.制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响

①用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药②向制剂中加入已知量的被测物进行测定

③与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较具体做法：

测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%～102%；容量法可达99.7%～100.3%二、精密度（precision）：定义:

同一样品多次测量值之间相互接近的程度表示：偏差，标准偏差,相对标准偏差

1.偏差(deviation,d)

d=测得值-平均值=Xi-X2.标准偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.

相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)

RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X×100%

重复性:

同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:

同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度重现性:不同实验室，不同人测定的精密度数据要求

均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限三、专属性（specificity）:指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性（鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性）

1.鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应

2.含量测定和杂质测定

色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。

图中注明各组分位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。

四、检测限（limitofdetection，

LOD)

是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法用含已知