基因工程原理

基因工程基本原理一、基因工程指利用DNA重组技术生产或改造生物产品、创建或改良动植物品种以及开发特殊用途的微生物等返回定义(基因重组技术、基因克隆或分子克隆)基因工程主要发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验基因工程主要发展史

1972年,美国斯坦福大学的PaulBerg研究组将SV40的一段DNA用EcoR1切下,连接到噬菌体载体上,转入细菌体内.他们工作的创新性就在于能将已经存在的零星的方法综合起来,建立了一项新技术.(1)第一次证明了基因重组技术的可行性.(2)第一次跨越种属界限的DNA重组(3)第一次证明重组DNA分子能整合到宿主染色体中,并被扩增.

1980年获诺贝尔化学奖.基因工程主要发展史

70年代后期,推动基因工程技术迅速发展的几大技术;1.多种类的限制性内切酶的纯化鉴定及商品化.2.DNA琼脂糖电泳技术的建立.3.核酸分子杂交技术4.大量克隆和表达载体的构建和商品化.5.DNA序列的分析6.外源基因导入哺乳动物细胞并在其中表达.7.体外DNA序列扩增技术(PCR)F.SangerDNA序列测定的双脱氧链终止法1985年K.Mullis建立了PCR技术

对基因的操作无所不能基因工程主要发展史具有抗病虫害的烟草转入人生长激素基因的小鼠与人类疾病和健康有关的相关基因已得到克隆和表达,胰岛素、生长激素、干扰素、细胞因子及多种单克隆抗体等基因工程药物已上市。在农业方面，抗病、抗虫、品质改良的新品种种植面积大量增加，转基因大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积为6770万km2（2003）基因工程主要发展史细胞核移植法---动物整体克隆技术鱼类和两栖的核移植早有成功(童第周).英国科学家Wilmut首次哺乳动物整体克隆成功,体细胞基因组的全能性.基因工程主要发展史米塔利波夫率领的研究小组成功克隆出猴子胚胎干细胞

基因工程主要发展史我国首批体细胞克隆医用小型猪07年5月在天津宝迪祖代种猪场出生，并有两头成功存活。

基因工程主要发展史基因工程主要发展史07年8月9号日本明治大学的一个研究小组培育出的第四代克隆猪

主要步骤：1、构建DNA重组分子2、重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定3、基因的表达返回一、基因工程(基因重组技术、基因克隆或分子克隆)目的DNA片段RE酶切质粒RE酶切连接重组质粒目的DNA转化无质粒的E.Coli死亡有质粒的E.Coli存活含抗生素培养基中生长基因工程基本程序构建DNA重组分子工具酶目的基因的制备克隆载体DNA分子的体外重组返回工具酶返回

限制性核酸内切酶（RE）DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端TaqDNA聚合酶又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而无53

外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等逆转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(RE)定义识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA几种限制性内切酶的作用位点返回目的基因制备方法：1、人工合成法2、逆转录法3、用限制性内切酶直接从染色体DNA中分离4、PCR法扩增人工合成法合成较小分子基因人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的缺点是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因时遗传密码兼并现象会为选择密码带来很大困难；3、费用较高逆转录法以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA；再以cDNA为模板，在DNA聚合酶I（或其KIenow片段）作用下，最终合成双链DNA（dsDNA）。可用于真核生物目的基因的获得返回逆转录法返回逆转录法缺点：1、mRNA必需提得很纯2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物，3、以单链cDNA为模板往往难以合成与单链cDNA一样长的ds－cDNA。组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合从基因组DNA文库获取目的基因目录TheNobelPrizeinChemistry1993PCR（聚合酶链反应）法扩增目的基因

发明于1985年模拟体内DNA复制的体外扩增DNA的方法PCR能够无线扩增DNAPCR基本原理

3’5’3’5’PCR3’5’5’3’5’5’targetsequence在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。pre-denaturation95℃for5min;Denaturation:95℃for30~60sAnnealing:37~68℃for30~60sextension:72℃for30s~2min72℃extensionfor10min30cycles反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension）PCR仪设定的反应条件：94oC45SDNA变性55oC45SDNA复性72oC1min产物链延伸

25-30个循环后72oC10min

一般地，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR：介绍：PCR仪如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。仪内发生的反应PCR变性退火延伸5

5

PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点94℃55℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR引物设计原则1、引物长度一般为15~30个核苷酸。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。4、两个引物之间不应存在互补序列。5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。7、引物的5′端可以修饰。引物设计方法例：通常在引物的5‘-端设计适当的限制性酶切位点引物设计软件介绍：PrimerPremier5.0Oligo6.57PrimerD'Signer1.1ArrayDesigner2.00PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断肿瘤

各种肿瘤检测

人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析其他……基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.质粒

(plasmid)独立于细菌染色体外的环状双链DNA。目录酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他DNA分子体外重组（外源基因与载体的连接）体外DNA分子重组方法：1.粘性末端连接2.平端连接