灭菌与空气净化

专题三灭菌工程与空气净化

一、灭菌的原理和方法

消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）的区别？

消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至60℃维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。

灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。

消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。

防腐（antisepsis）

防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。（1）低温（4）高渗（2）缺氧（5）高酸度（3）干燥（6）防腐剂

1.化学试剂灭菌法

甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.射线灭菌法3.干热灭菌法

电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭菌条件：160℃下保温1h适用范围：金属或玻璃器皿4.湿热灭菌法

利用饱和蒸汽灭菌，条件：121℃，30min适用范围：生产设备及培养基灭菌5.过滤除菌法

利用过滤方法阻留微生物适用范围：制备无菌空气

6.火焰灭菌法

火焰适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口

二、灭菌工程1、目的：

1）消除罐内死角，确保下一批发酵的成功

2）杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物

3）杀灭上批发酵的活的微生物，减轻环境污染

一）空罐灭菌2、步骤：

（热蒸汽法）1）先彻底清洗作用：a）有利于消除死角

b）免于料受热（尤其是干热的部位）干焦于罐体、管或阀门2）从底部通入蒸汽3）排冷气4）升压

打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如接种管、取样管、空气进管、流量计等）5）保压

通常1kg/cm2,30～60min6)降温

关闭各放气阀，切断汽源，慢慢放气；或自然冷却，或泵循环水加速冷却Notes:

a）确保无死角产生

b）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法

c）勿激碎视镜（一）加热灭菌原理1、微生物的热阻

每一种微生物都有一定的生长温度范围；

当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。二）、培养基灭菌的有关理论

微生物相对热阻细菌和酵母的营养细胞1细菌芽孢3×106霉菌孢子2-10病毒及噬菌体1-5某些微生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较）不同种类微生物对热的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力称为热阻（heatresistance）。1）致死温度（Deathtemperature）——杀死微生物的极限温度称为致死温度。下面介绍与热阻相关的几个概念2）热力致死时间(ThermalDeathTime;TDT)——在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。e.g伤寒杆菌58℃30min

变形杆菌55℃60min3）D值

------利用一定温度进行加热,90%的活菌被杀死时所需的时间(min)即为D值。又称1/10衰减时间。

DD=10min0102030405060加热时间(min)10510410310210106残存活细胞数残存活细胞曲线例：

含有某种细菌的悬液，含菌数为105/ml,在100℃（212°F）的水浴温度中，活菌数降低到104/ml时所需的时间为10min,则该菌的D值即为10min。

D100=10min

如果加热的温度为121℃，则常写成Dr4）Z值

——在加热致死时间曲线中，加热时间缩短90%所需升高的温度，即为Z值。10011510010加热时间（min)加热温度（℃）加热致死时间曲线ZZ=152、微生物的热死规律——对数残留定律

微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。

微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于蛋白质变性所致。

在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。对数残留定律的概念：

数学表达式：-dN/d=NN——培养基中活的微生物个数；

——时间（s）;

——比死亡速率（s-1）(死亡速率常数)dN/d——微生物的瞬间变化率，即死亡速率——对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。

若开始灭菌（

=0）时，培养基中活的微生物数为N0

=2.303logN0/N/

-dN/d=NlnN/N0=-

积分2.303logN0/N=

or

=2.303lgN0/N/

可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和

值◆

在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。◆

灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N=0，则为∞，上式无意义，事实上也不可能。

一般取N=0.001，即1000次灭菌中有1次失败。例：

有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每ml有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速度常数为1.8min－1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。解：N0=40×106×2×105=8×1012(个)N=0.001;=1.8(min－1)

=2.303

lgN0N=2.3031.8lg(8×1015)=20.34(min)3、死亡速率常数（比死亡速率）◆

死亡速率常数是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。◆

相同温度下，值越小，则此微生物越耐热。

在121℃，细菌芽孢的值约为1min-1,而营养细胞的值为10-1010min-1。细菌芽孢名称

值min-1枯草芽孢杆菌FS5230硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518硬脂嗜热芽孢杆菌FS617产气梭状芽孢杆菌PA36793.8-2.60.772.91.8121℃某些细菌芽孢的值4、培养基灭菌温度的选择◆

培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。◆培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。◆

灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残留定律表达式可知）。◆

在其它条件不变时，比死亡速率

与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示。SvanteAugustArrhenius

wasaSwedishphysicalchemistbestknownforhistheorythatelectrolytes,certainsubstancesthatdissolveinwatertoyieldasolutionthatconductselectricity,areseparated,ordissociated,intoelectricallychargedparticles,orions,evenwhenthereisnocurrentflowingthroughthesolution.In1903hewasawardedtheNobelPrizeforChemistry.=AeRTE－—ArrheniusequationA—比例常数；E—杀死细菌所需的活化能，(

E)

（×4.18J/mol）;T—绝对温度，(K)R—气体常数，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)=AeRTE－—lg=———+lgA－E2.303RT以lg

对1/T作图，得一直线，其斜率为-E/2.303R，截距为lgA，从斜率和截距科求得A和E值。1/Tlg

截距=lgA斜率=－E/2.303R培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：-dC/d=′CC—对热不稳定物质的浓度,(mol/L);′—分解速率常数（s－1）；

—分解反应时间（s）′随反应物质种类和温度不同在化学反应中，其他条件不变，′和温度的关系也可用阿仑尼乌斯方程表示：

′=A′eRTE′－—A′—比例常数；E′—分解活化能，(

E′)（×4.18J/mol）;T—绝对温度，(K)R—气体常数，[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)

1=AeRT1E－—

2=Ae－—ERT2相除取对数ln

2

1=E11RT1T2－〔〕在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数和培养基成分破坏速率常数′都变化。温度由T1升高到T2，值分别为：同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：ln

2′

1′=〔〕RT1T2E′11ln(

2

/1)ln(

2′

/1′)＝EE′上面两式相除，得由于灭菌的E大于培养基成分分解的E′名称E(J/mol)叶酸泛酸维生素B12维生素B1嗜热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌肉毒梭菌70.387.996.792.1283318343因此ln

2/1＞ln2′/1′

即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。

根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的方法，有利于减少营养成分的破坏。

灭菌温度/℃灭菌时间/min维生素B1破坏量/%10040099.3110366711515501204271300.581450.0821500.01＜12、pH◆

微生物在pH6.0～8.0范围内耐热性最大◆

pH低于6.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。（二）影响培养基灭菌的主要因素1、微生物热阻（前述）

温度孢子数灭菌时间(min)(℃)(个/ml)pH=6.15.35.04.74.51201000087533

11510000252516131311010000706535302410010000740720180150150

pH对灭菌时间的影响影响培养基灭菌的主要因素（continued）3、菌的浓度浓度越高，所需灭菌时间越长例如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在105℃湿热灭菌时间

芽孢杆菌数/ml时间(min)9×108489×106369×104209×1021492影响培养基灭菌的主要因素（continued）4、培养基成分◆

油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性

因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的传入。◆

而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性影响培养基灭菌的主要因素（continued）5、泡沫

泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其中潜伏的微生物；易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。6、颗粒颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。影响培养基灭菌的主要因素（continued）三）分批灭菌（实罐灭菌）（一）操作1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。

若已先行空罐灭菌，此步可不进行2、预热向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70℃左右。作用：利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，确保培养基的浓度。3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。4、罐压达1kg/cm2(0.1MPa)时，按装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。升温阶段5、保温调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保温阶段6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内压力降至0.5kg/cm2左右时，向罐内通入无菌空气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压降温阶段ABCD升温保温降温小型罐升降温快，可忽略；但大型罐不可忽视℃min(二）灭菌时间的计算V=V加热

+V维持

+V冷却

RT2(E–2RT)V加热

=————————·t加热

(T-T0)E2

RT2(E–2RT)V冷却

=————————·t冷却

(T-T0)E2R：气体常数；=1.986[卡/克分子·K]E：耐热孢子致死的活化能；=65000[卡/克分子]T：灭菌维持温度；121℃（393K）T0：开始计算灭菌效果的温度；100℃（373K）

1.986×3932(65000–2×1.986×393)V加热

=————————————————×5=1.15(393-373)×650002

1.986×3932(65000–2×1.986×393)V冷却

=————————————————×5=0.69(393-373)×650002V=V加热+V维持+V冷却

=1.15+15+0.69=16.6(min)例1

小型发酵罐在120℃灭菌维持15分钟，由100℃（100℃以下灭菌效果不计）加热至120℃的时间为5分钟，由120℃冷却到100℃的时间为3分钟，计算总的灭菌时间。例２

如果灭菌条件不变，大罐由１００℃加热到１２０℃需２４分钟；冷却至１００℃的时间为１６分钟；求大罐的维持时间。

1.986×3932(65000–1.986×393)V加热＋V冷却=————————————————×（２４＋１６）

(393-373)×650002

＝９.２min则大罐维持时间V维持=V－（V加热＋V冷却）＝16.6–9.2=7.4min在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间发酵罐规模（升）１２０℃维持时间（分）

20017.550012.6500011.3500008.8（三）分批灭菌的优缺点优点：◆不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。◆对蒸汽的要求较低，一般3-4kg/cm2即可满足。缺点：在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大◆中小型罐经常采用四）、培养基的连续灭菌（连消）

将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。

温度（℃）时间（min)12124.81304.11380.721460.141540.0291630.0061灭菌时间与温度的关系（以杀死细菌芽孢为准）

配料罐（兼作预热）

输料泵

连消塔（器）维持罐（管）

冷却器

发酵罐（一）连续灭菌流程1配料罐3连消装置4维持罐6冷却装置1、预热可在专门的预热罐，也可用配料罐兼作温度：一般预热至70℃左右预热的物料用泵泵入连消装置输料泵：

常用旋涡泵、往复泵、螺杆泵旋涡泵往复泵螺杆泵2、加热常用连消装置有三类：

套管式连消器汽液混合式连消器喷射式加热器物料泵入加热器，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升至130～140℃套管式连消塔上疏下密，45°小孔，孔径6毫米左右培养液流动线速度小于0.1m/s;在管内逗留时间为15～20秒

汽液混合式连消器1喷嘴2吸入口3吸入室4混合喷嘴5混合段6扩大管喷射加热器3、保温保温设备（维持设备）保温材料包裹两种形式：

罐式；管式

1、维持罐连续灭菌时，关2开1；预热罐中的物料输送完后，关1开2。培养基的平均停留时间=V/FM---平均停留时间（s）V---维持罐的体积（m3）FM---培养基的流量（m3/s）Note:

培养基在维持罐的流动不可能非常均匀，可能产生沟流，造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的3～5倍。经验：在灭菌温度为130℃时，实际平均时间可取10分钟；在140℃时则可取3～4分钟。2、管式维持器在设计管式维持设备时，须采用停留时间分布的概念，而不能采用单纯的停留时间。圆管内不同流动形式流体的速度分布情况

湍流

Vaverage=0.82Vmax

活塞流

Vaverage=Vmax

粘滞流

Vaverage=0.5Vmax

在管式维持器中，若培养基流动为活塞流，可根据维持管的内径、培养基的流量求出管长。

但实际上培养基不可能呈活塞流，当培养基处于粘滞留状态时，管内速度呈抛物线，管中心部位的最大流速为平均流速的2倍；若以平均流速确定管长，则会造成