基于蛋白组学技术的食品科学研究

基于蛋白组学技术的食品科学研究

人类工作组计划完成后，对生命的全面分析将致力于对生命的遗传信息的系统研究。这些遗传信息的生物功能，即蛋白质研究，成为了一门新学科。蛋白组学是一门新学科，通过研究氨基酸、蛋白组学和代谢组，可以进入后者的生命研究阶段。组学技术的应用也促进了与食品科学相关DNA、RNA、蛋白质和小分子代谢物的研究以及相关数据库的建立。2001年的Science杂志已把蛋白组学列为六大研究热点之一,其“热度”仅次于干细胞研究,名列第二。蛋白组学的受关注程度如今已令人刮目相看。蛋白质组(Proteome)是指由基因组表达产生的所有相应的蛋白质。与具有同源性和普遍性的基因组相比,蛋白质组是对某一生物或细胞在特定生理或病理状态下表达的所有蛋白质的特征、数量和功能进行系统性的研究,能提供全面的细胞动力学过程的信息,具有动态性、时间性、空间性和特异性,更能在细胞和生命的整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律。这就促使了蛋白质组学研究相对于基因组学研究越来越受到人们的重视,目前已有望成为解决生命科学领域中诸多问题的工具,其中也包括食品科学领域。食品质量与安全事关人民群众身体健康和生命安全,已成为人们时刻关心的焦点问题。消费者期望食品生产者和经营者能够提供优质、安全的食品,然而食品品质是一个复杂的综合问题,食品原料的性质、贮藏条件及加工过程中各种条件等诸多因素都会影响到食品的品质与安全性。由于蛋白质是多数食品的主要组成成分,因而蛋白质组分析能够提供参与决定食品品质的各种生理机制过程中的蛋白质的结构和功能等方面的更多信息,因此蛋白组学为食品科学研究提供了崭新的思路和技术。目前,蛋白质组学在食品科学领域中的应用还处于一个早期阶段,但已有了许多新的发现,表现出了广阔的应用前景。就蛋白质组学的主要研究技术及其发展作一综述,并着重介绍蛋白组学在食品科学研究中的进展和应用前景。1一般概念与研究内容1.1组prote研磨1994年,澳大利亚悉尼Maquarie大学的MarcWilkins等首先将蛋白质组(proteome)定义为“基因组所表达的全部蛋白质,包括各种亚型及蛋白质修饰”。这个概念的提出标志着一个新的学科——蛋白组学的诞生,即以蛋白质组为研究对象,应用相关研究技术,从整体水平上来认识蛋白质的存在及活动方式(表达、修饰、功能、相互作用等)的学科。1.2质组功能模式总体上看,蛋白质组研究可分为两个方面。一个是对蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究,另一方面是对蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系)的研究。目前蛋白组学研究的主要内容包括:①蛋白质的发现与功能的明确;②蛋白质翻译后的修饰特征;③蛋白质结构分析;④蛋白质活性的调节;⑤蛋白质的相互作用及其构象研究;⑥蛋白质的转运分析以及亚细胞结构中的蛋白质分离;⑦蛋白质的表达分析;⑧生物信号转导与代谢途径分析等。2常用的蛋白组学技术及其评价蛋白组学研究的核心技术为:蛋白质组分分离技术,蛋白质组分的鉴定技术,利用蛋白质信息学进行蛋白质结构、功能分析及预测。目前,主要有三种常用的蛋白组学技术,即2–DE分离经胶上原位酶解后的质谱鉴定技术、特异性酶解后多维色谱–质谱联用蛋白质鉴定技术(MudPIT)和抗体芯片表面增强激光解析电离法检测技术(SELDI–TOF–MS),方法的选择取决于研究目的和可利用的仪器设备。虽然发展了几种途径的蛋白质表达分析技术,2D–PAGE与MS结合仍是目前最经典也是应用最广泛的方法。2.1蛋白质点的检测和分离双向电泳技术是一种用来从复杂的样本中分离蛋白质的电泳方法,其基本原理是,第一步是根据蛋白质等电点(PI)的不同来分离蛋白质,称作等电聚焦(IEF)。通过固定pH梯度技术(IPG)可以实现非常精确的蛋白质分离并具有高度的可重复性;第二步是根据蛋白质分子量大小的差别,采用经典的SDS–PAGE电泳来达到蛋白质分离的目的,在2–DE分析中,蛋白质根据它的分子质量和所携带的电荷移到特定的位置,形成蛋白质点图谱,一个蛋白质点就代表一种单个的蛋白质。蛋白质点的饱和度显示的是那个细胞所产生的实际蛋白质数。2–DE在数小时内可同时分离大量蛋白质,应用大面积胶,一次可鉴定多达10000个蛋白质点;可通过蛋白质点染色的强度对其进行定量分析,也可提供蛋白质翻译后修饰信息,具有不同程度的糖基化或磷酸化修饰的蛋白质亚型能较容易地进行分离。在过去40年中已经测定了许多物种和组织的2–DE胶图谱,其中包括猪、牛、鸡和水产品等,一些图谱已经被用于获得与食品品质性状相关的分子标记。在过去20年中,质谱技术(MS)已经从分析小的挥发性分子发展到一个很广的应用范围,包括对蛋白质和肽的分析。应用质谱分析可进行蛋白质鉴定和序列测定,其基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子之间的质荷比的差异来分离并确定相对质量。在离子化方法上,现多采用电喷雾离子化(ESI)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)的软电离方法,样品分子进行电离时能保留整个分子的完整性,而不会形成碎片离子,又称肽质指纹图谱(Peptide-MassFingerprinting,PMF)技术。这些电离方法是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI–TOF)和电喷雾电离–串联质谱(ESI–MS/MS)技术的核心,将它们结合起来使用是蛋白质组学中一个经典的成就。PMF是一种现在运用最广的用来鉴定2-DE分离出来的蛋白质和肽的方法,已经成功地应用于鉴定包括全部的家养动物在内的许多生物的蛋白质。2.2定性定量测定MudPIT技术先由特异性的胰蛋白酶消化,产生的多肽由强阳离子交换柱和反相HPLC分离后经ESI–MS/MS分析。同位素亲和标签可标记对照组和处理组样品的蛋白质,从而得到蛋白组的定量信息。而且用13C标记多肽加入到蛋白质消化混合物中,可用于样品制备过程中肽回收率的测定。由于MudPIT法采用高速且高灵敏度的色谱分离法来代替耗时的2-DE蛋白质分离法,故其与经典的2–DE–MS法相比,具有快速、样品需要量少和多肽分离的通用性强等优点,但MudPIT法不能提供蛋白质异构体和翻译后修饰的相关信息。2.3seldi技术SELDI技术通过离子交换柱或LC分离蛋白质,并通过芯片上抗体、底物等的亲和力从蛋白质混合物中直接获得单个或多个目标蛋白。故SELDI技术能从复杂蛋白质样品中富集蛋白质亚群,所得蛋白经激光解析离子化后进一步质谱鉴定。SELDI技术的样品制备简便,减少了样品的复杂性,特别适于转录因子等低丰度蛋白质的检测,并能迅速进行蛋白质的表征。然而该方法目前仅可应用于分子质量不大于20ku蛋白质的分离鉴定,且分子质量精确度低于经典的2-DE-MS法。2.4蛋白质组分析数据库验数据的获取、加工、存储、检索与分析来获取所得数据的生物学信息。在获得了编码蛋白质的DNA序列后,其表达蛋白的功能研究成为下一步分析的主要目的。蛋白质信息学(ProteinBioinformatics)在蛋白质组分析中起重要作用,一是通过与数据库中的已知蛋白质相比较来判断未知蛋白质的功能;二是预测蛋白质的结构,并判断蛋白质有无发生修饰。蛋白质组学中出现的大量复杂数据需要整合许多其他来源的数据,包括表型以及结构基因组和功能基因组数据,数据搜集和合并是蛋白质组分析中一个主要的任务,近年来出现了一些处理数据的先进算法和软件,并且还存在着许多开放性资源和商业化的数据库平台。蛋白质组数据库被认为是蛋白质组学知识的储存库,包含所有鉴定的蛋白质信息,如蛋白质的顺序、核苷酸顺序、双向凝胶电泳、三维结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等,一些开放性的蛋白质组数据库见表1。这些数据库涵盖了人类和经典的模式生物如小鼠、大鼠和酵母。生物信息学的发展使蛋白质的鉴定更方便、更快捷,而且随着基因组学的深入研究,能够为蛋白质组学研究提供更全面的数据库。3通过蛋白组研究3.1小麦蛋白组学及应用影响农作物品质和产量的因素很多,近年来运用蛋白质组学技术与方法对其机理进行研究和探讨,对农产品性状的改良和产量的提高具有积极作用。Natarajan等对野生型和栽培型大豆种子的蛋白谱进行分析后,发现二者具有相似性,提高大豆蛋白中含硫氨基酸的浓度,可以显著的改善大豆蛋白的品质。在提高农产品产量方面,Bahrman等通过比较蛋白质组学方法研究不同小麦品种间氮肥施用效果的差异,研究发现氮水平对小麦籽粒数量、干重和含氮量的影响是很显著的,该研究对今后更好地采取提高产量的有效措施具有重要的意义。蛋白组学能够提供与小麦品质及籽粒硬度相关的蛋白质组成的相关信息,为小麦品质的改良提供指导,同时也可以预测面包的品质。谷物蛋白质组学在小麦谷蛋白、醇溶蛋白等种子贮藏蛋白影响面团黏弹性及烘焙品质方面已有一些研究。Amiour等采用2–DE分离得到目的蛋白点,采用MALD–TOF和ESI–MS/MS对小麦籽粒进行了蛋白组学研究,以增加对小麦籽粒中两亲性蛋白的生理功能的了解。Salt等经研究证明小麦生面团中形成泡沫的可溶性蛋白对面团中的气泡具有稳定性作用。科研人员分别利用双向电泳技术对小麦胚乳、面筋及灌浆期的小麦胚乳进行了蛋白组分析,试阐明相关的生物化学特性,为提高面食产品的质量奠定理论基础。何中虎等对中国小麦品种品质评价体系建立与分子改良技术的研究取得了重要进展,特别是通过蛋白质组学方法发现了与面筋强度直接相关的水溶性蛋白WS-6,以及运用改进的SDS方法明确了面包和面条对亚基组成的要求等研究成果,为进一步推动小麦品质改良工作提供了新的理论依据。3.2蛋白组理论在肉品学研究中的应用3.2.1白质组学研究肌纤维分两种类型:红肌纤维和白肌纤维,这两种类型在代谢水平上存在着结构和功能的差异。纤维类型与肉质性状比如多汁性、风味和嫩度之间的关系有很多争议,尤其是纤维类型对肉嫩度的影响仍然不清楚。利用能描述生长表型和独特的嫩度性状的动物模型(如牛的双肌和羊的肥臀性状)进行蛋白质组学研究,可以更好地了解生长和肉质性状之间相关的分子机制。Doherty等阐述了蛋鸡胸肌蛋白质组的特性,揭示了生长期几种相关的蛋白质在表达水平上均有极大的变化。Boule等应用蛋白质组研究牛骨骼肌的过度生长现象,表明肌肉生长抑制素(Myostain)基因上有11对碱基对缺失导致13种肌肉蛋白质发生了改变。包括收缩蛋白和代谢蛋白,这些蛋白质绝大多数是来自有收缩性的器官组织,并能够加快肌纤维的收缩功能。同时,他们发现随着肌肉收缩特征的改变,肌肉蛋白质的代谢模式也发生了改变。Lametsch等通过研究发现猪的补偿性生长可以改变其肌肉的蛋白质组,这有助于进一步了解补偿性生长与蛋白周转变化、肉质软化之间的关系。尽管这些研究还未能得出肌肉生长和肉品质性状最主要的联系,但是蛋白质组意义上的观察将对理解骨骼肌的生长规律起到重要有用,而且在将来的研究中可能为肌肉生长和肉品质性状如何相互联系提供信息。3.2.2蛋白质组变化由于屠宰后肌肉早期的生化现象在很大程度上影响肉的品质,因此了解屠宰后肌肉的代谢活动与肉品质的关系是肉品学关注的一个主要的焦点。研究表明,与理化性质相关的参数、组织化学性质、温度、基因型及其他诸多因素都会影响到屠宰后肌肉的代谢活动,然而对于屠宰后肌肉的代谢活动与肉质之间的关系却知之甚少。一般说来,使肉变得僵硬的因素会显著影响嫩度,这些因素包括电刺激、压力、冷却速度和屠宰前的营养状况,因此建立能够描述屠宰后肌肉蛋白质组变化的动物模型是一个挑战性的工作。Lametsch等首次利用蛋白质组分析了屠宰后猪肌肉的变化情况。他们采集了刚屠宰至屠宰后48h肌肉的蛋白质组样品,这些肌肉蛋白质从5~200ku不等,pH值在4~9之间,结果发现蛋白质组模式发生了15种显著的变化。此后,Lametsch等通过研究最终确定了可作为肉品质标记的20多种蛋白质,包括结构蛋白质(肌动蛋白,肌球蛋白和肌钙蛋白T)和代谢酶,如肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶。在这些标记蛋白中,人们发现肌动蛋白和肌球蛋白重链(MHC)与肌肉的剪切力之间存在极显著的相关,这表明屠宰后肌动蛋白和MHC的降解会影响肉的质量。Remignon等直接对肌肉蛋白片段进行分析,认为蛋白质的改变很可能是导致家禽PSE肉综合症的直接原因,但目前对于具体是哪些蛋白质发生了改变以及这些蛋白质如何被修饰还知之甚少。Molette等研究发现火鸡(BUT9)屠宰后胸肌糖酵解的速度比较快(屠宰后每20分钟pH值比正常的多下降0.5),从而使得肉品质发生改变,如系水力下降,加工产量降低,嫩度降低。3.2.3起羊肥臀原因分析研究表明钙激活中性蛋白酶在肉的嫩化中起到一个关键的作用,其限速因子是calpastatin介导的对屠宰后钙蛋白酶活性的抑制作用。引起羊肥臀主要原因是由于18号染色体的突变,导致钙激活中性蛋白酶的活性增加强两到三倍。肥臀羊死后肌肉结构的变化与其他类型的羊相似,但发生的速度较慢,这就表明了钙激活中性蛋白酶系统在肉嫩化中的重要作用。Lametsch等研究报道了具体的肌纤维蛋白由钙激活中性蛋白酶介导的降解图谱,肌动蛋白、肌钙蛋白和一些原肌球蛋白异构体的特定降解图谱也将被测定,这些肽的图谱与肉嫩度之间的关系仍需要进一步的分析。3.3不同冷冻储存条件对鱼肉蛋白质图谱的影响鱼贝类等水产品的基质同畜禽肉一样,无论从细胞水平还是从从组织水平都是由大量的蛋白质组成。显然,蛋白组学在水产品原料组成、贮藏加工过程中的品质变化、蛋白质之间及蛋白质与其他成分之间的相互关系等方面的研究中同样具有重要价值。Kjaersgard等在11种不同冷冻储存条件下对鳕鱼肌肉蛋白质图谱进行了分析,发现不同冷冻储存温度对蛋白质图谱无显著影响,但是经过不同的冷冻储存时间(3个月、6个月和12个月),肌浆球蛋白轻链、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶A、2–α肌动蛋白片段等蛋白质的浓度发生了显著变化,从而导致鱼肉质地和味道特有的变化。Bosworth等对受低氧温胁迫的斑马鱼的鱼肉进行研究分析,发现低氧对6个低丰度蛋白产生影响,而不影响蛋白的表达模式。Martinez等将双向电泳技术用于鱼种属和鱼肉组织的鉴定,研究了北极和热带品种死亡后的变化特征及某些添加剂在鱼肉加工过程中的影响。3.4蛋白组研究在哺乳研究中的应用3.4.1编码关键酶的基因特征蛋白质水解是影响乳制品质地的关键因素,所产生的肽类一般是风味物质的前体,或具有独特的生物学特性。2–DE可用于考察蛋白水解酶对蛋白质的降解作用。Kunji等为了研究L.lactis中β-酪蛋白水解途径,将蛋白水解系统中编码关键酶的几个基因切除,结果表明细胞壁上有关的蛋白酶具有底物特异性,主要表现在β-酪蛋白的C–末端,并且存在有能转移至少10个残基的寡肽转移系统,只有少数的肽类能被转移到细胞中。Deutsch等比较了瑞士奶酪中几种嗜热乳酸菌的细胞提取物的水解作用,包括Lactobacillushelveticus、Lactobacillusdelbrueckisubsp.lactis和Streptococcusthermophilus,其中L.helveticus水解β-酪蛋白的能力最强,但存在于水解产物中的磷酸肽几乎不能被降解,用相同的底物对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以及4种丙酸菌研究也能得到类似的结果。3.4.2在微生物蛋白组中的应用3.4.2.蛋白质的分离和鉴定Anglade等报道了L.lactis的第一个标准凝胶,得到了450个银染斑点,鉴定了15个蛋白质。通过2DE分离蛋白质,再由肽类质谱图及搜索数据库而实现蛋白质的鉴定。由于基因组数据库中乳酸菌的信息还不完全,因而限制了蛋白质的鉴定。Perrin等对生长于M17–乳糖培养基上的嗜热链球菌进行研究,用2D–PAGE分离并通过N–末端测序来鉴定,建立了一种相当精确的对斑点指数化的方法。在所用的分析条件下只检测到了大约理论蛋白质组的17%。目前有很多工作致力于更精确地描述乳酸菌蛋白质组。3.4.2.关于乳酸菌的差异表达乳酸菌中蛋白质的差异表达研究最多的是L.lactis,对它的差异研究主要是2个菌株之间或不同培养基上生长的细胞所产生的蛋白质组的比较。Guimont等比较了在M17培养基或牛奶中生长的不同St.thermophilus菌株的蛋白质组成,不同的菌株和培养基对蛋白质组成的数量及性质都有影响,牛奶基质中酶的产量要比M17培养基低。大多数有关乳酸菌的差异表达研究集中在胁迫反应和适应方面,这有助于更好地理解乳酸菌的适应反应及相关的交叉保护机制,将乳酸菌应用于特定的工业过程。Rechinger等采用35S标记的方法,结合2–DE和N–末端测序,以动力学方式研究了保加利亚乳杆菌在合成培养基与牛奶中所表达的蛋白质的差异,他们发现将细胞从MRS培养基转接到牛奶中后不会诱导胁迫酶或糖酵解酶的大量合成。3.5通过蛋白组研究3.5.1大豆蛋白质的组成食品蛋白质测定的传统方法不能得到纯的蛋白和氨基酸序列等信息,而蛋白组分析则可轻易获得这些重要信息。目前,食品蛋白组学研究主要集中在富含蛋白的大豆、乳品蛋白组成和活性成分的研究。Gianazza等采用2–DE–MS法发现不同蛋白质组成的大豆对人体血浆脂蛋白等水平有影响,其中血浆7S和11S球蛋白变化显著。Smolenski等采用MudPIT和2–DE–MS法表征牛奶蛋白组,分别发现2903和2770个多肽,说明牛奶成分比先前报道的更为复杂,还鉴定了15种与机体防御机能有关的蛋白。3.5.2转运体蛋白测定食物营养素的营养价值和其它功能不仅与自身的成分有关,还依赖于其在胃肠道中的消化和吸收,但目前对消化酶和上皮细胞营养物质的转运体却所致甚少。蛋白组分析表明,大鼠小肠存在一些小肠分子伴侣蛋白、细胞骨架可塑性蛋白和维生素转运蛋白等以前未发现的蛋白质,比如:胃肠调理素、α-细丝蛋白和VD结合蛋白前体等。Alpert等在体外用内毒素或病原菌处理小肠上皮细胞后,2–DE–MS法分析发现有25种和18种蛋白质分别上调和下调表达,这些蛋白可能与炎症条件下营养素的消化和吸收不佳有关。3.5.3小鼠细胞结构变化和代谢相关蛋白表达的变化蛋白组学技术为糖尿病、肥胖、衰老、心血管疾病等营养代谢与调控异常疾病的机制研究提供了新的途径,阐明了营养素代谢和调控机制。Li等采用2–DE–MS法比较了青年人与老年人正常结肠粘膜上皮细胞蛋白质组,发现代谢、能量产生、分子伴侣、抗氧化、信号转导、蛋白质修复和细胞调亡相关蛋白质出现差异表达。这些研究有助于理解人营养吸收与代谢相关细胞衰老的分子机制。Bluher等比较了脂肪敏感胰岛素受体基因敲除小鼠的脂肪细胞内蛋白质表达差异,发现27个脂质和能量代谢通路的关键蛋白上调或下调表达,其中转酮醇酶、延伸因子–2和葡萄糖调节蛋白–78等与胰岛素信号转导和脂肪细胞大小调控密切相关,其中14种蛋白质可能由相应mRNA表达量变化引起,13种可能由蛋白质翻译或周转引起,这说明胰岛素可以在转录和翻译后修饰水平影响蛋白质的表达模式。这些研究结果进一步加深了人们对营养物质代谢调控网络的了解。3.6蛋白组学与食物机构各种食品安全突发事件,如食物过敏事件、沙门氏菌、李斯特菌污染事件、疯牛病事件等已经引起人们对食品安全的极大关注。其中,食物过敏是一个全世界关注的焦点问题。随着社会环境和生活方式的巨大变化,人类的饮食环境进入多样化时代,过敏性疾病的发病率随之亦呈持续快速上升的趋势。最近调查显示,我国15~24岁年龄段健康人群中,约有6%的人曾患有食物过敏。成年人多对海鲜有过敏反应,大约有7百万美国人对海产品过敏,占美国总人口的2.3%,其中0.5%的成年人对虾类产品过敏。海鲜过敏是由免疫球蛋白IgE对海产品中一些特殊蛋白质(如结构蛋白:原肌球蛋白等)反应引起的。蛋白组学为食物过敏原的鉴定和表征提供了技术支持。Yu等采用2–DE–MALDI–TOF技术研究了斑节对虾的致敏原,结果显示该致敏原是一种具有精氨酸激酶的蛋白质,它能与虾过敏性病人血清IgE发生反应,从而引起虾过敏性病人的皮肤过敏反应。Koller等采用2–DE和MS/MS及能够检测、鉴定超过2500种蛋白质的多维蛋白质鉴定技术对水稻(Oryzasativa)的叶、根和种子组织进行了系统的蛋白组学研究,结果在种子样品中鉴定出了几种已经表征过的过敏性蛋白,显示了蛋白组学技术在食物过敏事件的监督中具有很大的潜能。近年来,随着我国市场食品品种的丰富,加工手段的