海参多肽的分离纯化及功能特性研究

海参多肽的分离纯化及功能特性研究

海洋科是属于嗜水性动物和嗜水性动物的。根据人参科的外部特征，它被分为四个目和九个科（分支手：瓜参、沙鸡科、高球参科；献花主题：新纳科、海参和刺科；甘薯参科：甘薯参科；无足目量：锚定参科和指状参科）。全世界约有1100种海参,其中40种可食用,我国有100多种,其中20多种可食用。干制的海参蛋白质的成分很高,接近90%,多糖6%左右,脂质约占4%,含有少量核酸以及钙、镁、铁、锰、锌、铜、钼、硒等微量元素。不同种类的海参由于生长环境的不同,其营养价值和生物活性也有所差异,其中以刺参营养价值最高,属于海参中的精品,被称为“参中之冠”。自古以来,海参作为营养食品和保健食品被广泛使用,海参常被制成海参干粉、海参熟制品、海参罐头等,大量的应用是把海参作为食品原料进行简单的初级加工。海参多肽是以新鲜海参为原料,经过蛋白酶酶解,分离纯化得到的具有功能特性的生物活性物质,研究发现海参多肽具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗疲劳等多种功能。本文主要对海参多肽的生物活性以及制备分离纯化方法进行介绍,为海参多肽在食品、医药、保健品等行业的应用提供依据和思路。1人参的生物活性1.1实践抗氧化能力生物体内氧自由基(oxygen-derivedfreeadicals.OFR),主要包括超氧阴离子(O-2·)、羟自由基(·OH)、羟过氧自由基(HOO·)、有机过氧自由基(ROOy)等,在生物体内不断产生,也不断地被分解,处于动态平衡之中,维持在一个正常的生理水平上。若体内自由基过量,可损伤体内的蛋白质、核酸和生物膜,引起各种疾病。而自由基清除剂可清除体内自由基,保护机体免受氧化损害。因此,近年来,对体内自由基清除剂的研究备受关注,如超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-PX)、抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione,GSH)和维生素等。海参是一种高蛋白低脂肪的食品,不仅体腔液内GSH以及总抗氧化能力的含量高,而且动物实验证明海参多肽可以提高机体内的抗氧化酶的酶活。侯付景等通过小鼠喂养实验表明东海乌参(Acaudinaleucoprocta)水解液使小鼠血清和肝脏组织中的SOD、GSH-PX活力明显提高,MDA(丙二醛)含量显著降低,有效清除体内堆积的自由基。有关研究表明,海参多肽抗氧化性的强弱主要与多肽的氨基酸组成、氨基酸序列以及空间构象有关。而目前研究主要集中在不同海参多肽的抗氧化能力与多肽分子量和浓度之间的关系,赵玲等测定比较了大西洋海参(HolothuriacoluberSemper)、东海海参(AcaudinamobpadioidesSemper)、刺参(Apostichopusjaponicus)和加州拟刺参(Parastichopuscalifornicus)这4种海参多肽的抗氧化活性,其结果显示大西洋海参多肽、刺参多肽和加州拟刺参多肽分别对·OH、DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)和O-2·的清除能力最强。不仅新鲜海参多肽具有良好的抗氧化能力,有研究表明带有内脏的干制海参制备的多肽具有更高的抗氧化能力,并且不同浓度海参多肽抗氧化能力也不同。苏永昌等的研究表明随着海地瓜(Acaudinamolpadioides)多肽浓度的增加,多肽对羟自由基的清除能力迅速上升,当多肽浓度大于20mg/mL,多肽清除羟自由基能力则表现为平缓的上升趋势,其清除羟自由基和超氧自由基的IC50(halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance,半抑制浓度)分别为12.5、23.6mg/mL。此外,王静等还发现不同分子量海参(Apostichopusjaponicus)多肽清除·OH、O-2·、H2O2的IC50也不同,其结果表明:4种分子量范围的海参多肽清除3种氧自由基的能力存在差异,大小顺序为CPHIV(<3ku)>CPHIII(3~5ku)>CPHII(5~10ku>CPHI(>10ku),分子量越小的海参多肽清除3种氧自由基的能力越大,4种分子量范围的海参多肽清除O-2·的效果最好,其次是H2O2,最后是·OH。1.2费用抑制剂的活性随着人们生活水平的不断提高,高蛋白、高脂肪的摄食越来越大众化,高血压的患病率也逐步上升。血管紧张素转换酶(Angiotension-Ⅰ-convertingEnzyme,ACE)是肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensnisystme,ARS)和激肽释放酶-激肽系统(Kal1ikrein-KininSystme,KKS)的关键酶,在ARS中,ACE将无升压活性的血管紧张素Ⅰ水解为具有升压活性的血管紧张素Ⅱ,在KKS中,ACE使具有降压活性的缓激肽降解失去降血压活性。通过以上两个途径,ACE参与体内血压调节,造成血压的升高,引发高血压。海参多肽作为一种有效的ACE抑制剂,就是通过抑制血浆和血管内皮细胞ACE的活性从而达到降低血压的目的的。有研究表明,分子量<2ku的海参多肽具有较强的ACE抑制活性,其中海地瓜体壁蛋白水解物<2ku的多肽ACE抑制活性的IC50值达0.615mg/mL。不同酶的酶活和作用位点的不同导致酶解产物的分子量分布不同,影响其ACE抑制活性。赵元晖等比较了Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、3942中性酶、Alcalase2.4L六种海地瓜蛋白水解液ACE抑制活性的大小,结果表明:6种蛋白酶水解液对ACE抑制效果从大到小依次为:菠萝蛋白酶水解液>Ⅰ型胶原酶水解液>Alcalase酶水解液>3942中性酶水解液>木瓜蛋白酶水解液>胰蛋白酶水解液。Forghania也比较了糙海参(Goldenseacucumber)六种不同酶酶解液的ACE抑制活性的大小,发现碱性蛋白酶酶解液具有最高的ACE抑制活性,IC50达0.41mg/mL,其次为风味蛋白酶,然后是菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶,最后为胰蛋白酶和复合蛋白酶。海地瓜酶解物经过类蛋白反应(类蛋白反应是指利用浓缩的蛋白质在合适的条件下经蛋白酶的作用合成的类蛋白产品)修饰后,ACE抑制活性能够明显升高。ACE抑制活性的大小主要与其ACE抑制肽的C-末端氨基酸序列有关,其中主要与三肽序列有关,Monti等研究证实,ACE抑制肽的C-末端三肽序列含疏水性氨基酸(芳香族氨基酸或带支链氨基酸),活性较强,若其中C-末端三肽序列中含有一个脯氨酸或者含有一个带正电的氨基酸如赖氨酸(ε-氨基带正电荷)、精氨酸(胍基带正电荷),其活性也会明显增强。1.3管理和作用细胞的活性海参多肽除具有抗氧化和降血压活性之外,还具有降血脂、抗疲劳、抗癌以及镇痛等生物活性。Rodriguez等将从海参(Holothuriaforskali)酶解液中提取的多肽喂养大鼠,检测其对大鼠血脂的影响,结果显示海参多肽在明显升高血清高密度脂蛋白的含量的同时降低血清甘油三酯的的水平,从而达到降血脂的效果。王海涛等研究结果发现刺参(Apostichopusjaponicus)多肽具有比较好的抗疲劳的效果,其作用机理主要为能够显著降低运动后小鼠的血尿素氮含量以及提高其肝糖原含量,且功效随着灌胃剂量的提高而增强。付学军进一步研究了不同浓度的低分子量的海参肽对小鼠抗疲劳的作用,结果发现低分子量的海参肽对小鼠的体重没有明显的影响,具有显著的抗疲劳作用。王奇等也验证了海参的抗疲劳活性,通过动物实验还发现东海海参多肽能够提高小鼠的记忆力,其作用机制可能是上调小鼠内记忆相关基因转录水平的表达。卢连华和谢永玲研究了海参肽对小鼠的免疫调节功能的影响,结果表明海参肽能够增强小鼠体液免疫功能、非特异性免疫功能以及自然杀伤(HK)细胞。王奕通过动物实验研究日本刺参(Apostichopusjaponicus)多肽的抗肿瘤作用,结果表明不同剂量组的日本刺参胶原蛋白多肽均能够显著抑制小鼠S180肉瘤的生长。有研究还表明鲜海参的提取物对体外培养的人胃癌细胞栋(MGC)、人肝癌细胞株(7402)以及小鼠的乳腺肉瘤细胞栋(EMT6)的生长有显著的抑制作用。Shinichi等还从日本刺参中分离出一种五肽和七肽,其研究结果表明这两种小分子的多肽能够促进生殖细胞的形成和卵母细胞的成熟。除此之外,Ridzwan利用动物实验证明玉足海参(Holothurialeucospilota)、图纹白尼参(Bohadschiamarmorata)的水提取物、糙刺参(Stichopushermanii)的腹腔液都具有良好的镇痛作用。海参多肽的多种生物活性正在逐渐被人们认识,大量的动物实验证明了海参作为保健品和功能食品的潜力。2参比和体外膜的制备近年来,对于不同种类海参多肽的制取、精制已经有较多的报道,但是对于其活性结构的鉴定研究才刚刚开始。目前,海参多肽的制取常采用酶解法,制备不同生活活性的海参多肽选择的酶也不尽相同,常采用复合蛋白酶和中性蛋白酶;精制主要围绕脱盐、脱色进行,常用活性炭或者大孔树脂物理吸附进行脱色,柱层析进行脱盐,制备高商品性状的产品。2.1复合蛋白酶对工质及酶解的影响生物活性肽的生产方法主要包括从自然界中提取天然活性物质、蛋白质降解以及化学合成法。其中,在海参多肽的制取过程中,应用最成熟的技术为蛋白质定向酶切,即利用不同的酶或者微生物对海参进行蛋白质降解获得具有不同功能的生物活性多肽。在酶解过程中,通过酶种类的选择,酶解条件的控制(加酶量、反应温度、反应时间、底物浓度)来得到具有特定生理功能的生物活性肽。向怡卉等利用复合蛋白酶水解海参生殖腺,制得水解度达50%的海参蛋白液。水解度是衡量水解程度的一个重要指标,水解度越高,水解得越彻底,但多肽的含量不一定高。因此,为了得到更高含量的多肽,张彧等选择多肽得率作为目标来控制海参的酶解,得到多肽的得率为42%左右的海参多肽。海参多肽的肽链中含有羟基、氨基和羧基等多种亲水基团,能够与水分子结合,是很好的吸湿剂,同时由于其分子量小,很容易被皮肤吸收,不但维持肌肤的吸水还具有良好的保湿效果,因此,其吸湿性和保湿性同样受到人们的关注,朱洪珍等选择中性蛋白酶对海地瓜进行酶解,得到吸湿率和保湿率分别为6.11%和81.23%的海地瓜胶原蛋白多肽。人们在研究选择合适的外加酶进行海参多肽的酶解的同时也在关注海参自身的酶对其酶解的影响。郑杰等的研究进一步验证了海参肠内酶的作用,其研究表明,海参肠自溶水解物具有一定的DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)清除能力、Fe2+螯合能力和还原能力。结合之前的研究以及实际生产的需要,王静等将海参体内酶与外加酶结合使用,将完整的海参匀浆后诱导其自溶,以自溶后水解液为底物,加入复合蛋白酶进行二次水解,从而提高酶解效率,二次水解后海参多肽的得率从34%提高到约为60%。2.2海u2004脱盐与植物活性海参多肽的精制过程一般包括预处理、分离、纯化和纯度测定四个阶段,其中纯化是最为关键的阶段。利用酶解法制备海参多肽的过程中主要存在着盐含量过高、颜色过深等问题,因此海参多肽的纯化主要围绕着脱盐、脱色进行。在酶解过程中,根据不同的酶的最适pH,必须通过不断的加酸或者碱来维持体系pH的稳定,因此水解物中含有一定量的盐分,这些盐分对海参多肽的理化性质、适用范围和生物活性产生影响。目前常用的脱盐的方法有离子交换树脂法、透析法和超滤法。王静等采用透析法和超滤法对刺参多肽进行脱盐纯化,脱盐率达到85%左右。海参体壁的大量色素经过酶解沉积到海参多肽中,导致海参多肽颜色过深影响其开发利用,张翠玉等研究了NKA-9、AB-8、D392、D280、D101、D315六种不同的大孔树脂对海地瓜多肽的脱色效果。结果表明:树脂D392可较好的用于海地瓜多肽的脱色,脱色率达到83.2%,多肽保留率为80.5%。海参经过酶解得到多肽的分子量分布大约为500~3000u,分子量的不同对多肽的抗氧化性、ACE抑制活性等功能都有影响,分离并纯化不同分子量范围的多肽对研究其生物活性具有重要意义,目前常用的纯化方法主要有:柱层析、高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。赵元晖等利用SephadexG-25凝胶柱层析、SPSephadexC-25阳离子交换层析、反相高效液相色谱层析对海地瓜复合酶水解产物进行分离纯化,得到两种高活性、高纯度的ACE抑制肽。王洪涛等将海参酶解液先经过醇沉、离心分离海参多肽和蛋白,再对海参蛋白和多糖分别进行纯化,得到较高纯度的海参多肽和多糖,使得海参的营养价值得到更好地应用。2.3pro-gly-tyr-met,突出了神经肽类的结构及功能迄今为止,国内外的学者主要对海参中的一些活性成分比如海参多糖的提取、分离纯化以及结构鉴定进行了较多的报道,但是对于海参多肽的结构组成的研究比较少。有研究表明,海洋多肽的生物活性与多肽的氨基酸序列、多肽的结构、疏水性以及所带的电荷有关,因此测定海参多肽的结构为我们更好的研究海参生物活性提供基础。目前国外学者对氨基酸序列的测定做了大量的工作,Birenhenide从海参中分离出两种多肽,一种为Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg,另一种为Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg,属于神经肽类,主要影响海参真皮的硬度及弹性。Miranda从海参(Holothuriaglaberrima)中分离出两种肽,一种为Gly-Phe-Ser-Lys-Leu-Tyr-Phe-NH2,命名为GFSKLYFamide,另一种为Ser-Gly-Tyr-Ser-Vak-Leu-Tyr-Phe-NH2,命名为SGYSVLYFamide,其中GFSKLYFamide对海参神经肌肉的结缔组织有重要影响。SunilKumar等从海参(CaudinaArenicola)中分离出一种四肽,经测定得出其结构为Pro-Glu-Leu-Leu,是C球蛋白的94-97片断。我国学者LiuZunying等从巨型红海参(Parastichopuscalifornicus)中提取胃蛋白酶可溶性胶原蛋白属于Ⅰ型胶原蛋白,但在氨基酸组成与Ⅰ型胶原蛋白有一些不同。赵元晖等应用纳升电喷雾—四极杆—飞行时间串联质谱(Nano-ESI-Ms/Ms)技术,对从海地瓜中分离得到的ACE抑制肽P1、P2进行结构鉴定。P1的精确分子量为1629.7u,氨基酸序列为YYLEMDFLLFNY;P2的精确分子量为1034.5u,氨基酸序列为MEGAQEAQGD。但是海参多肽的氨基酸序列和