放射毛霉液体培养条件研究

放射毛霉液体培养条件研究

优雅辐射布雷因as3.2278是优良的腐殖树种，在培养独特的口感方面发挥着非常重要的作用（王瑞志，1998），但国内外的研究主要集中在细菌育种和固体培养的生理特性上（尹广林，1992）。目前尚未见到有关其液体培养及其药理活性的报道，将液体毛霉菌种应用于腐乳生产的研究也为空白。为了改进腐乳生产中菌种制作的传统工艺，将现代发酵工程技术应用于腐乳生产，进一步实现腐乳生产工艺的自动化、规模化，提高腐乳产品的质量，作者进行了毛霉AS3.2778的液体深层培养和工业规模发酵研究及其在腐乳生产上的应用。液体发酵制种工艺具有生产过程机械化程度高、发酵周期短、劳动生产率高、菌种纯度高等许多优点。其多糖的抗氧化活性研究，为进一步认识与利用微生物宝库提供了技术储备。以现代生物工程技术改造传统产业对我国相关产业发展必将起到极好的促进作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验中的菌株1.1.21.2方法1.2.1发酵培养基正交实验设计在以前研究的基础上（王丽英等，2001），发酵培养基正交实验按L9(34)设计三水平四因素实验（见表1）,9个组合，3次重复。采用250mL摇瓶置旋转式摇床培养。1.2.2根据每处理条件观察ph值最佳发酵温度试验设计了25、28和30℃三组对比；灭菌前培养基的pH值分别调到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0,每处理3个重复，摇瓶培养64h后，观察pH值的变化；在500mL三角瓶中分别装入50、100、150、200、250、300mL的培养基进行摇瓶培养，考察通气量对菌株的影响。1.2.3罐菌液培养发酵罐空消121℃30min,配料进罐，实消121℃30min后，冷却至30℃。火焰接种法将摇瓶液体种接入种子罐，接种量7%，发酵温度为(28±1)℃,消泡剂0.03%，通气体积比前期（0h～10h）为1:0.8,10h后为1:1.5～1:2.0，罐压0.05～0.07Mpa，全程不搅拌培养18～20h。放罐菌液经胶体磨粉碎处理后，管道喷雾接种，在豆腐坯前、后、左、右、上五面均匀喷洒，22～26℃培养，以传统茄形瓶菌种为对照。工艺员感官检测。1.2.4生物量以80目铜丝网过滤称重测定菌丝体鲜重。水洗菌丝体，置烘箱中80℃烘至恒重后称量测定菌丝体干重。1.2.5ph测量1.2.6糖原测试1.2.7氨基酸试验1.2.8制备沉淀、沉淀、研磨菌丝体过滤，水洗匀浆，加10倍体积水，100℃提取3h，离心收集上清液，沉淀再以8倍量水重复提取2次，合并上清液后浓缩至原体积1/5,Sevag法除蛋白两次，加入酒精并混匀使乙醇终浓度为70%，离心收集沉淀，用无水乙醇、丙酮依次洗涤所得沉淀，干燥后研磨即得。1.2.9免疫调节作用检验按照卫生部保健食品检验与评价技术规范（2003版）开展免疫调节作用检验。以小鼠腹腔巨噬细胞吞噬红细胞试验及迟发型变态反应试验进行，试验动物为昆明种小鼠，由河北医科大学实验动物中心提供。2结果与分析2.1培养基浓度对毛霉蛋白酶活力的影响由表2可知，影响菌丝生长量最显著的因子为黄豆粉，其次为饴糖、无机盐、酵母膏。由表3可以看出，在此培养基成分及浓度范围内，影响毛霉蛋白酶活力最主要的因素是饴糖，其次是无机盐。根据对其发酵周期、生长状况、蛋白酶活性的综合分析选定最适培养基为黄豆粉3%、饴糖0.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.2%、酵母膏0.1%。2.2不同培养条件对病原菌生长和酵母菌培养的影响见表1在温度梯度对比试验中，28℃发酵温度优于其它温度,为发酵最适温度。雅致放射毛霉在pH5.0～13.0范围的液体培养基内均可生长，以6.0～7.0为适。在100mL/500mL的通气量下组菌丝产量最高，说明菌丝体生长需要较高通气量，这与多种丝状真菌液体培养情况相同（王谦等，1999；龚建华和王义军，2002）；与机械搅拌发酵罐相比，气升式发酵罐具有结构简单、加工安装方便、密封性能好、杂菌污染机会小、氧传质效率高、功率消耗低等特点,且对微生物没有剪切破坏作用（Bello等，1985；张文会和高孔荣，1993），该项实验将另文报道。2.3膜过滤放罐出现鲜重在全程不用搅拌培养至18h～20h，生物量达30g/mL(鲜重)以上，符合应用要求，经镜检合格后放罐。放罐醪液菌丝体白色，棉絮状或成球，有特殊香气，菌丝体氨基酸构成及成分如表4所示。2.4做好稀释度的控制液体种子在豆腐坯上生长都很均匀，生长速度都较原工艺种液快，突出体现在无论稀释度大小，在24小时的菌丝都明显比生产种长。只是当稀释度较高时，菌丝在豆坯上的生长较为稀疏，不能形成与生产用种同样相当的致密厚实的皮膜，当稀释度控制在4倍时，基本上与原工艺种液是相当的。当稀释度小于4倍时，要较原工艺种液为佳。稀释度的大小与菌体的浓度是密切相关的，多次试验表明，当菌丝体湿重在25g/100mL左右时都可以得到同样的结果。发酵液在豆腐坯上的应用结果表明16h、20h、24h液体种在豆腐坯上都可以很好发酵，效果比原工艺种液效果好，可以使腐乳前发酵周期提前6h～8h，而且形成的菌膜更为致密厚实。2.5免疫调节效果测试2.5.1两组临床疗效对比由表5可知，雅致放射毛霉多糖免疫调节作用效果随浓度增加而加大，其中，20mL/kg和50mL/kg剂量与对照组相比达到显著差异（P>0.05）和极显著差异水平（P<0.01）。2.5.2晚发生动物变态试验：结果如表6所示结果表明，雅致放射毛霉多糖可增加小鼠耳肿胀度，其中50mL/kg剂量达到极显著水平（P<0.01），证明其可提高小鼠细胞免疫功能。3有关活性化合物的活性成分研究在本项目条件下，雅致放射毛霉的液体发酵培养可良好实现。检验合格的发酵液作为液体菌种完全可以取代传统工艺，可以在生产上得到很好的应用。多糖的免疫调节作用检验表明，雅致放射毛霉多糖具有一定的增强免疫力作用，具有进一步开发利用前景。雅致放射毛霉ActinomucorelegansAS3.2778菌株由北京王致和食品集团提供，4℃冰箱保藏，6个月转管