dpph法测定发酵条件对型乳粉抗氧化能力的影响

dpph法测定发酵条件对型乳粉抗氧化能力的影响

最近，食品的生理保健功能越来越受到重视，尤其是食品的抗逆性。大豆及大豆制品中含有多种抗氧化成分,除少量的生育酚和维生素C外,大豆中含有的黄酮类和酚酸类化合物,以及在发酵过程中产生的多肽类和褐色色素类物质等都具有抗氧化的活性。许多研究证明,大豆发酵制品比没发酵之前显示更强的抗氧化活性。Joan-HwaYangetal.(2000)的研究表明发酵的大豆汁比没发酵的显示更强的对1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)自由基的清除作用。Easki.H(1994)报告了日本豆酱(miso)、纳豆(natto)和天贝(tempeh)在发酵过程中产生了抗氧化的成分,而对我国的发酵大豆制品的抗氧化活性的研究还很少。腐乳是我国特有的大豆发酵制品,在我国有较大的消费人群,它营养丰富,同时又具有抗氧化,降血糖,降胆固醇等生理功能性。汪立君曾报道过用有机自由基1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)法对市售腐乳样品的自由基清除能力进行评价,并对其产生原因进行了大致分析,并通过对张晓峰,龚丽及Yasuda的研究分析,认为腐乳在发酵过程中,由于大豆异黄酮由糖甙向甙元转化以及蛋白水解产生的多肽,而产生了一定的抗氧化的作用。但是对于腐乳生产过程中的自由基清除能力变化过程却没有见到类似报道。为了探讨腐乳在生产过程中自由基清除能力的产生和变化过程,我们设计了本实验。本研究将腐乳生产中常用到的两株菌株进行比较,使用统一工艺生产腐乳,首次报道了腐乳生产过程中自由基清除能力的变化情况及不同发酵菌株对产品的自由基清除能力比较。1材料和方法1.1-取代乙基磺酸盐1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)美国sigma公司;α-生育酚(α-Tocoperol),日本Wako公司;2-(N-吗啉代)乙基磺酸(MES),美国sigma公司;其他试剂为分析纯。雅致放射毛霉ActinomucorelegansCICC3.118;少根根霉RhizopusarrhizusCICC3.078购于中国科学院微生物所。1.2日本科学公司的纺粘设备96-wellmicroplatereader(model550)日本Bio-RadLaboratories公司;多用振荡器(MS-1)日本Shimadzu公司;台式离心机(TCL-16C)上海安亭仪器厂。1.3制作腐败材料1.3.1调整培养浓度将麸皮∶水以1∶1.4混合,再加入2%葡萄糖配制成培养基,接入菌种,于恒温培养箱中28℃培养3d。加入200mL无菌生理盐水,充分搅拌洗刷出孢子悬浮液。镜检血球计数并调整孢子浓度为1.0×107个孢子/mL。此孢子悬浮液随用随配,不作保藏。1.3.2c原料大豆经过筛选,8～12h的浸泡,以7倍的水磨豆,100±0.5°C煮浆5min,冷却至80℃后以0.8MMgCl230mL/1000g浆的比例点浆,80℃蹲脑20min,5000g/20min压榨成型。1.3.3湿度对培菌的影响将腐乳白坯接种配制好的孢子悬浮液,摆笼后,在28℃,相对湿度大于90%的条件下培菌。48h后,白坯表面布满菌丝,经搓毛后,即为腐乳毛坯。1.3.43草甸盐处理将毛坯放入腌制罐中,以4/10(M/M)比例加入NaCl腌制,共腌制5d。1.3.5无盐后酵成熟将腐乳盐坯捞起、沥干、装入400mL容量的腐乳专用玻璃方瓶中,每瓶装毛坯8块,按质量比6/9和10/5加入无盐后酵汤料,用瓶盖拧紧瓶口,放入25℃的恒温培养箱中进行腐乳后酵成熟。1.4酶解-g-g将腐乳样品真空冷冻干燥、磨碎、置于4℃密闭保存备用。实验前将处理后的粉末称取0.5g,加入5mL50%乙醇溶液,充分浸润,超声,常温振荡提取1h。沸水浴灭酶15min,4000×g下离心15min,取上清液0.45μm膜过滤,滤液4℃保存待用。将沉淀再加入5mL50%乙醇溶液,重复上述离心过滤步骤,得到上清液备用。1.5测量1.5.1样品溶液的制备取上述各样品的提取液0.5mL,加入0.5mL0.2mol/L的MES缓冲液和1mL乙醇混合作为待测样品溶液。1.5.20.2mmol/li-废水中的形成86mgα-生育酚溶解于10mL50%乙醇,使用前取出1mL,定容至100mL,避光储存。1.5.3200mol-lph溶液的制备3.94mgDPPH溶解于25mL乙醇,使用前与0.2mol/L的MES缓冲液按1∶1混合,避光储存。1.5.4加样检测方法对Ellman的光度检测方法稍作改进,使用96孔微孔板进行检测,按表1进行加样,混合均匀,于室温下避光放置20min,然后在520nm下测定其吸光值。每一吸光值平行测三次,取其平均值。1.5.5数据处理以浓度为单位，形成相应的浓度和吸收值线性，并以具有相同抗剂活性-为标准曲线。样品的抗剂活性通过去除dpph中的相同浓度或吸收值的相同金额来表示，gi-用于患有酚类抗剂的mg样品2结果与讨论2.1清除dpph能力的测定按表1的α-生育酚的添加量做出标准曲线,如图1所示。α-生育酚的浓度和OD520值有非常好的线性关系,相关系数R2=0.9985,得到的标准曲线方程为:Y=-0.0066x+0.7731。抗氧化剂的浓度与清除DPPH能力呈显著线性相关关系,而DPPH的剩余量与吸光值成正比。通过图2样品的吸光值的变化,在标准曲线上计算出同等DPPH清除率所对应的α-生育酚的浓度差,即可换算出样品的α-生育酚浓度当量,单位表示为μgα-生育酚/mg样品。2.2不同菌种对乳饮料抗氧化活性的影响由图3可见,无论雅致放射毛霉还是少根根霉,它们的自由基清除能力变化趋势基本相似,由大豆制成豆腐白坯,单位重量的样品自由基清除能力有所下降;接上菌种发酵后,自由基清除能力升高;在进入盐腌阶段后,自由基清除能力又稍有下降;而在加入汤料进入后酵阶段后,自由及清除能力又开始上升。其中需要提出的是,盐腌阶段以及后酵阶段的样品中,盐含量较高对其干物质的维生素当量的换算存在一定偏差,但是总体来看整个腐乳生产过程阶段的自由基清除能力基本是逐步上升的,腐乳终产品自由基清除能力比豆腐白坯分别高了2.29倍和2.04倍。图4是去除了盐含量的样品的抗氧化活性的变化曲线,由此图可见,大豆比起豆腐白坯,抗氧化活性均有下降的趋势,维生素E当量由3.56μgα-生育酚/mg下降至2.49μgα-生育酚/mg,其原因是部分蛋白和异黄酮等具有抗氧化活性物质在豆渣和黄浆水中的流失,如汪立君等的研究发现,在豆腐的制作过程中有44%的异黄酮损失在黄浆水里;在前酵阶段,样品的抗氧化活性稍有提高,这个阶段主要的是菌体迅速生长繁殖,并产生大量的蛋白酶为主的酶系,在盐腌过程中自由基清除能力持续上升,这是和图3的曲线趋势是有区别的,后酵阶段样品的抗氧化活性继续升高,分别从6.94和6.28μgα-生育酚/mg上升到12.75和11.67μgα-生育酚/mg,分别较发酵前的白坯高了5.12和4.69倍,其原因应该是在整个腐乳的生产过程中,在蛋白酶的作用下,蛋白降解为多肽之后抗氧化活性大幅度的提高了,同时,根据刘欣以及张晓峰的研究,腐乳终产品中所有的异黄酮糖甙形式全部都转化成了甙原形式,也提高了产品的抗氧化活性。纵观整个生产阶段,前酵阶段的自由基清除活性变化最迅速,盐腌阶段次之,后酵阶段最为缓慢。图4还显示出了不同菌种发酵对于腐乳产品的自由基清除能力的影响差异。由图可见,雅致放射毛霉所发酵的腐乳(以下简称毛霉型)比用少根根霉发酵的腐乳(以下简称根霉型)的自由基清除能力更强,抗氧化活性更高。在前酵结束时,毛霉型之比根霉型高0.32μgα-生育酚/mg,高了8.2%,在盐腌、后酵3周和终产品阶段分别高了10.5%,20.7%,8.4%。这应该与雅致放射毛霉的蛋白酶活性高于少根根霉有关,更高的蛋白酶活使得更多的蛋白被分解成多肽,因而使产品具有更强的自由基清除能力。而刘欣的研究结论认为,不同菌种的前发酵腐乳,其异黄酮含量变化有显著差异。因此不同菌