利用蛋白酶水解制备功能性多肽的研究进展

利用蛋白酶水解制备功能性多肽的研究进展

通过蛋白质水处理产生的功能豆是目前功能食品研究的热点。因为功能豆具有促进矿物吸收、抑制细菌、抗高血压、抗抑郁、抗疲劳、神经调节、免疫调节等生理活性。这些功能是由现有的蛋白质或其组成的氨基酸组成的。许多活性物质的组成氨基酸不一定需要氨基酸，因此它们为更广泛使用蛋白质资源提供了新的机遇，尤其是为那些认为生物效应低的蛋白质资源提供新的机遇。本文对近年来酶解蛋白质制备活性肽的研究做一综述。1活性肽的制备方法,和性好通过酶法制备生物活性肽,生产成本低,产品安全性高,生产条件温和,水解进程易于控制,可定位生产特定的肽,能较好地满足生产需要,是目前活性肽的主要制备方法。酶法制备活性肽的操作要点包括:蛋白酶的选择、酶解工艺的优化及酶解产物的活性评价3个部分。1.1抗大肠杆菌o157h7蛋白酶的选择是酶法制备活性肽的关键步骤。在酶的筛选过程中,应以原料蛋白的组成和酶的专一性为参考,也可根据目标活性肽的结构特点进行选择或通过酶工程来生产特定酶。根据水解方式不同可将目前常用蛋白酶分为以下2类:(1)内切酶:作用于蛋白质分子内部肽键。包括动物蛋白酶,如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等;植物蛋白酶,如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等;以及微生物来源蛋白酶,如丹麦Novo公司生产的碱性蛋白酶Alcalase、复合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase等。另外,也有研究者直接利用微生物在原料中发酵,如Leblanc等用瑞士乳杆菌发酵牛奶得到抗大肠杆菌O157∶H7感染的多肽;(2)外切酶:作用于蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键,生成游离氨基酸,其中作用于氨基末端的称为氨肽酶,作用于羧基末端的称为羧肽酶。外切酶的一个重要特性就是能够把处于肽链末端的疏水性氨基酸水解出来,降低多肽的苦味。常见的一些蛋白酶及其作用位点见表1。由于酶的专一性,不同蛋白酶的水解位点不同,而且2种或2种以上蛋白酶同时作用于底物时,往往具有协同增效作用,因此为了提高酶解效率必要时可采用复合酶水解蛋白。张红梅等采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解制备大豆蛋白,经优化后水解度可达23.43%。当前水解蛋白大多采用间歇式操作,即原料蛋白达到预期水解程度后,经过灭酶,脱盐和分离等工艺得到产物,该流程存在酶不能重复使用、生产成本高、每批次的产品品质难控制等缺点。20世纪60年代兴起的固定化酶技术可以解决酶的重复性使用问题,但由于酶的固定化可能会使酶的空间构型发生变化或导致酶与底物的接触面积减小,造成一定的酶活损失,从而限制了该技术在蛋白酶解中的推广。为了降低蛋白水解成本、克服固定化酶技术的不足,一种新的蛋白水解装置———酶膜反应器应运而生。酶膜反应器是将酶催化反应和膜分离耦合在一起的装置,集反应、产品分离和酶回收再利用于一体,它是在膜反应器上改进而成的。其原理是利用膜的选择透过性和膜两侧的推动力(如压差、电势差等),来分离出产物,同时将酶和未完全水解的底物截留,使其重新回到反应体系中。这样可以大大提高酶使用的重复性,同时还可以减少酶解过程中产物抑制现象,从而可以获得较高的酶解反应速率和转化率。张赛赛确定了MWCO5k的再生纤维素膜包为从酶解液中分离富ACE抑制肽的适宜超滤膜包。并采用中性蛋白酶在酶膜反应器中水解酪蛋白连续制备ACE抑制肽,其得率达43.4%,单位时间产量为6284mg/h,单位活力酶对应的产量为0.23mg/U,产物的ACE抑制率达81.6%,整个系统持续稳定反应达8h以上。大大提高了酪蛋白原料和中性蛋白酶的利用率,降低了生产成本。1.2微波辅助酶解酶解过程研究的主要目的在于确定酶解工艺条件,如底物浓度、加酶量、酶解温度、pH、时间等,并在单因素试验的基础上,通过正交或响应面等试验设计优化酶解工艺。姜莉在单因素试验的基础上,以水解度为响应值采用中性组合试验设计(CCD)和响应面方法(RSM)优化了胰蛋白酶对核桃蛋白的水解工艺:反应时间4.0h,底物质量浓度27g/L,温度53.4℃,pH8.0,加酶量(E/S)8.3g/kg,该优化条件下水解度可达14.49%。随着酶解技术的不断发展,在蛋白质酶解过程中,为使酶解反应更加高效彻底,缩短酶解时间。超声波、微波等作为一种辅助手段越来越多的应用到了蛋白质酶解工艺中。微波是一种频率为300MHz至300GHz之间的电磁波,可以穿透样品,由内而外瞬间达到一定的温度。且微波能将能量同时传递给体系中所有的反应活性中心,提高反应速率。微波辅助酶解主要包括2方面的辅助作用,一是利用微波加热预处理原料蛋白质,使其结构变松散,暴露出更多酶作用位点,使水解反应更快更有效。崔蕊静等以豆奶为原料,对比了微波和直接加热2种预处理方式对水解效果的影响,结果表明,底物浓度为1∶10的豆奶,在微波功率180W下处理20s,加入2%的等比混合的木瓜蛋白酶和风味蛋白酶,控制pH7.0,60℃下水解3h,所得水解液中氨基氮含量比豆奶于90℃直接加热10min后酶解所得的氨基氮含量提高近30%,且水解时间缩短了1/2。另一方面是在水解过程中用微波加热代替常规的水浴加热。微波加热的特性能够保证酶的活性,缩短反应时间。李磊采用中性蛋白酶和酸性蛋白酶协同酶解大豆分离蛋白(SPI),并在酶解过程中采用多次、间断性微波加热,结果表明在微波功率150W加热,控温45℃~50℃,间断性加热每次1min,酶解15min即可达到常压酸水解6h的水解度,缩短了反应时间,提高了水解效率。超声波具有空化作用,产生的气泡经挤压破裂,可以瞬间产生极强的机械剪切力,使蛋白质降解,或者改变蛋白质构象,促使其亲水基团更多地暴露出来,提高蛋白质在水中的溶解度,有利于酶与蛋白相结合,最终提高酶解效率。超声波在蛋白酶解上的应用也主要是体现在原料蛋白预处理和酶解过程这2个方面。贾俊强采用超声波预处理大米蛋白制备抗氧化肽,经优化得到最佳超声预处理工艺为:超声功率1500W、超声处理时间20min、超声处理初始温度40℃,该条件下的抗氧化肽得率为33.2%。与未经超声预处理比较,抗氧化肽得率提高了43.7%。李艳伏在明确木瓜蛋白酶对核桃蛋白的最佳酶解工艺基础上,进行了超声功率和时间对酶解影响的研究,结果表明超声功率为450W,超声12min,蛋白水解度可由10.18%提高到11.43%。可见低功率超声波可增加反应系统内流体的循环速度,强化传质,扩大了底物与酶接触的面积,提高酶水解速率。1.3体外检测结果的比较生物活性肽的活性是指生物活性肽作为外源性物质对机体所产生的影响。对于多肽的生物活性评价方法主要分为体外和体内(动物实验)实验2种,目前,对于大部分多肽的活性研究主要以体外检测为主,体内活性研究相对较少。虽然动物实验能够较为真实地反映活性肽的功效,但是存在测定方法复杂,实验周期长,经费投入大,具有风险性的弊端。与动物实验相比,体外检测简化了实验操作,缩短了实验周期并节约了实验经费,不失为一种有效、快捷的研究手段。但某些情况下体内实验和体外实验的结果也会出现一些差异,主要表现在以下2个方面:一是在体外有很高的活性,但在体内却效果甚微,一个重要的原因是口服后,活性肽被动物消化道的酶进一步分解,使多肽的结构发生了变化或者由于胃肠道环境不适应活性的发挥,从而使功效降低。另一种情况是在体外活性很低的肽口服后却表现出很强的活性,可能是这些活性肽被摄入体内后经胃肠道的蛋白酶进一步降解成了活性更高的短肽;也可能是胃肠道的环境(如pH)更适宜其活性的发挥。所以在活性肽的功能评价方面如果仅仅采用单一的体外检测手段并不能很好地反映出它对机体的作用效果,因此,有必要选择体内、体外检测体系来综合评定其活性能力及作用机制。王莉娟以体外抗氧化活性为检测指标,研究了水解过程对大豆肽抗氧化活性的影响,并且在酶解产物的分离纯化过程中,又同时采用了体外的脂质过氧化体系和D-半乳糖建立的小鼠衰老模型对产物的抗氧化活性进行了综合评定。2反相高效液相色谱柱及凝胶过滤色谱在酶法生产生物活性肽的研究中,酶解产物的分离纯化是一个重要环节。目前,报道中可以用于肽的分离纯化的方法有很多,其中色谱法是生物活性肽分离纯化的重要手段,反相高效液相色谱柱适用于混合体系中肽的快速分离和检测;正相液相色谱则适用于亲水性肽的分离;凝胶过滤色谱是依据肽的分子量大小和形状进行分离;离子交换色谱(IEC)、毛细管电泳(CE)以及毛细管等电聚焦(CIEF)电泳等则可根据肽的电荷特性对其进行分离。此外,超滤(UF)、结晶化、逆流分布、分配色谱法、疏水交互作用色谱(HIC)也可被用于肽的分离纯化。其中最常用的是以下4种。2.1非极性大孔吸附多肽的分离纯化这是一类为吸附和筛选性相结合的非离子型高分子吸附剂,容易再生,在分离纯化蛋白质、多肽和氨基酸等生物活性物质时具有条件温和、设备简单和操作方便的特性。根据大孔吸附树脂的结构表面不带或带有不同极性的功能基,可分为非极性、中极性和极性3类。其中采用DA201-C型非极性大孔吸附树脂对多肽进行分离纯化取得了较好的效果。常玮采用DA201-C型大孔吸附树脂对大豆7S球蛋白碱性蛋白酶水解液进行疏水性氨基酸富集,使得组分的疏水性值由分离前的4.91提高到7.17,ACE抑制活性由73.10%提高到86.29%。2.2活性肽凝胶的制备这是一种根据样品分子大小、形状差异进行分级分离的方法,该法是所有色谱技术中最简单、条件最温和的方法,具有重复性好、样品回收率高的特点。在多肽的分离纯化中使用的也最广泛。常用于活性肽分离的凝胶有:交联葡聚糖(Sephadex)、聚丙烯酰胺(BioGel)、交联丙烯基葡聚糖(Sephacryl)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和交联琼脂糖(SepharoseCL)。可根据样品的分子量级别选择不同种类及型号的凝胶进行分离,其中Sephadex是最常用的一种基质。玄国栋采用sephadex-15分离米糟蛋白酶解物获得了6个明显的多肽组分,其中组分5的ACE抑制活性最高,IC50为0.011mg/mL。2.3阳离子交换剂的制备离子交换色谱是基于溶质分子带不同性质的电荷和不同电荷量,并可在固定相和移动相之间发生可逆交换作用的分离手段。按结合基团的不同,离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。在肽的纯化中,由于肽链相对于蛋白质较短,所带电荷强度较弱,大多研究者主要选用具有强带电基团的SP-SephadexC-25进行分离,这种阳离子交换剂由于基质Sephadex的存在,在根据电荷强弱分离样品的同时,还具有分子筛的功能。Won-KyoJung等人在水解东白令海刺黄盖鲽(Limandaaspera)制备ACE抑制肽时,将分子量小于5ku的多肽混合液通过SP-SephadexC-25,得到9个组分,其中组分7的ACE抑制活性最强IC50为210μg/mL。2.4分离和制备细胞的活性成分,其重点在于通过外环在肽的纯化中,RP-HPLC是最常用也最高效的方法,它是根据溶质、极性流动相和非极性固定相表面的疏水效应建立的一种色谱模式,主要用于分子量低于5ku的小分子肽的分析和纯化。像以十八烷基键合硅胶(ODS柱)作为固定相,水和甲醇等作流动相的分配色谱过程。该法具有快速、高效和高回收的特点,在分离和制备肽上有独特的优越性。刘志东在乳抗氧化活性肽的制备过程中将经Sephadex-15分离得到的最高抗氧化能力为53.3%的乳肽组分,又经RP-HPLC进一步分离纯化得到了6个组分峰,其中组分3的抗氧化能力最强为61.3%。一般来说,根据要分离的样品的理化性质(如电荷特性,分子大小,分子极性等)和各种分离方法的不同原理相结合来选用一种或几种方法进行样品的分离纯化,以避免选择方法的盲目性。如M.Kuba等在制备大豆ACE抑制肽的试验中采用高多孔性苯乙烯吸附树脂DIAIONHP21SS和SEPABEADSSP-825阳离子交换树脂初步分离酶解液,将收集到的活性组分进一步通过RP-HPLC得到4个组分。经蛋白质测序仪测得其氨基酸序列分别为Leu-Ala-Ile-Pro-ValAsn-Lys-Pro、Leu-Pro-His-Phe、Ser-Pro-Tyr-Pro、TrpLeu。其中前3条多肽链是首次发现的具有ACE抑制活性的肽段。3质谱法分离纯化及结构序列分析较早的测定蛋白质和多肽序列的方法主要是自动Edman降解法和DNA转译法,这2种方法相对较为成熟,至今也是测序中主要使用的方法。但在某些情况下也会体现出一些不足,如N端有封闭的基团、肽链中存在改性的氨基酸或不常见的氨基酸以及肽链的疏水性很强时都会使Edman中断或产生错误。DNA转译法用于测定分子较大的蛋白质有效,而对于分子量较小的肽段的分析往往不可取。近年来,随着质谱分析技术日新月异的发展,特别是快速原子轰击(FAB)、电喷雾(ESI)、基体辅助激光解吸(MALDI)等软电离方法的诞生,使得质谱在生物领域的应用很快得到发展,已逐渐成为鉴定蛋白质及多肽的优选方法。快速原子轰击质谱FAB-MS克服了传统质谱中样品必须加热气化的限制,而且在测序过程中具有用量少、方便和快速、适合小分子多肽检测的优点。对于N端有封闭基团的多肽也适合采用FAB-MS检测。电喷雾质谱ESI-MS采用的是电喷雾源的离子源,是目前属最软的电离方式,它适用于强极性、稳定性差、大分子量的样品分析,在测定过程中样品以溶液的形式导入,使得它可以与具有高分离效能的RP-HPLC直接连用,使质谱法与已有的蛋白质分析方法能很好地匹配,可以在线检测出HPLC上分离出的每一个肽段的分子量,扩大了质谱在蛋白质和肽领域中的应用。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS):具有操作简单、快速、谱图直观、能耐受一定浓度的盐和去垢剂等特点,在准确测定样品分子量的同时还可测定其序列结构。刘佳在制备大豆蛋白A