乳清蛋白的生物活性及其应用

乳清蛋白的生物活性及其应用

乳清蛋白富含必要氨基酸，是一种高含量的优质蛋白质。它含有许多活性物质，如含有蛋白质-谷氨酸、蛋白质-谷氨酸（氨基）、牛血清蛋白（bsa）、免疫球蛋白、乳铁蛋白（lf）、糖苷（gsmp）、乳酶等。随着乳源活性肽研究与产品开发的兴起,发现乳清蛋白中含有具有免疫调节、降血压、降血糖、降胆固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性的潜在肽段,这对进一步提升乳清蛋白产品的营养功能,提高乳清蛋白产品的附加值及开发利用具有重大意义。本文就近年来有关乳清蛋白及其活性多肽的研究进展进行了综述。1乳清蛋白主要成分乳清蛋白是牛乳中的一类集营养性、功能性于一身的重要蛋白质,其主要生物活性成分包括β-乳球蛋白(β-LG)、α-乳白蛋白(α-LA)、血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白和酪蛋白糖巨肽(CGMP)等,其中α-乳白蛋白约占20%,β-乳球蛋白约占50%。此外,乳铁蛋白(LF)、乳过氧物酶、β-微球蛋白、溶菌酶、多种生长因子及λ-球蛋白等微量成分也是乳清蛋白不可或缺的组成部分,在乳清蛋白生理功能方面发挥着重要作用。乳清蛋白中各组分及主要生理功能见表1。2青酮及其化合物的生物学活性2.1乳清蛋白的保护作用由于耐抗生素致病菌的出现,具有抗菌特性的蛋白质成为研究热点。乳清中含有具有广谱抑菌特性的成分,能够杀伤细菌、真菌、病原虫,抑制病毒繁殖和特异性抑制某些肿瘤细胞生长。2004年,Leonie等通过动物实验和细胞实验证明乳铁蛋白是一种抗菌抗毒剂,乳铁蛋白上的正电荷对抵抗巨细胞感染具有重要作用,通过抑制病毒侵入细胞来抵抗巨细胞病毒的感染。随后,Weng等通过体外和体内实验证明,牛乳铁蛋白(LF)能抑制病毒和宿主细胞发生作用,保护ICR小鼠免受肠病毒71型侵害。近几年来,研究发现乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白进行化学改性可以增强其生物活性。2007年Pan等将乳铁蛋白酰胺化以改变其蛋白质分子结构而增加其净正电荷数,结果表明酰胺化的乳铁蛋白对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌能力增强。酰胺化β-乳球蛋白对荧光假单胞菌、莓实假单胞菌、枯草芽孢杆菌具有很强的杀菌作用。同年,Miralles等研究发现β-乳球蛋白与壳聚糖发生美拉德反应后,糖基化β-乳球蛋白对大肠杆菌具有杀菌作用。随后,Sitohy等发现酯化后的乳清蛋白对脊髓灰质炎病毒Ⅰ型和柯萨奇病毒B6型的抗性作用,通过抑制病毒蛋白质的转译以及与病毒衣壳蛋白发生疏水性作用来减缓这两种病毒增殖。乳清蛋白与癌症防治的关系也被广泛的研究。2009年,Castro等研究了不同浓度的乳清分离蛋白对B16F10黑色素瘤细胞增殖的影响,发现低浓度的乳清分离蛋白(0.98～100mg/mL)更有利于抑制癌细胞增殖。2.2分离蛋白的免疫调节作用乳清蛋白中含有调节免疫功能的成分,并且乳清蛋白降解产生的多肽在机体免疫调节中也发挥着重要的作用。乳清蛋白能够增强免疫细胞功能,加速抗体生成,增强巨噬细胞的吞噬能力以及刺激机体淋巴细胞的增殖。近几年的研究结果表明,乳清蛋白中的免疫调节成分还能够抑制肿瘤生长。Kay等通过动物实验和细胞实验证明IMUCAREWPC可增强有丝分裂原(ConA)刺激小鼠脾脏淋巴细胞的免疫反应。同时,Mercier等证明在细胞培养基中添加浓度为100μg/mL的MF-WPI(微过滤法获得的乳清分离蛋白)可以促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖。随后,Gauthier等于2008年通过细胞实验和酶联免疫法研究乳清蛋白及其胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶复合酶解产物的免疫调节特性,结果表明乳清分离蛋白能够刺激小鼠脾脏细胞的增殖,并且酶解产物能明显增加γ-干扰素的分泌。2.3抗氧化活性的检测方法研究发现,人类的衰老和许多疾病如心肌梗死、动脉硬化、癌症、骨质疏松症和肥胖等都与人体产生的自由基有关。通过摄入具有抗氧化活性的物质可有效降低体内的自由基含量,防止氧化反应的发生,提高机体对疾病的抵抗能力。各类天然抗氧化剂以其低毒、高效等特点正越来越受到人们重视。目前,已有利用乳清蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白制备抗氧化肽的报道,也有研究表明乳清蛋白水解物在铁催化卵磷脂脂质氧化体系、铜催化脂质氧化体系中具有抗氧化作用,另外,乳清蛋白水解物还可以减少熟肉制品冷藏过程中的脂类氧化。在多肽抗氧化活性评价体系中,基于不同自由基清除原理,常用的抗氧化活性检测方法主要有:DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基、氮氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力等。其他常见的检测方法还有脂质体系的抗氧化抑制能力和还原能力法等,一些高灵敏度的新型检测技术也被逐渐引入到抗氧化活性的检测方法中。2009年,Kong等利用电子自旋共振仪测定了纯化后的不同分子量范围乳清蛋白肽对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基的清除能力,发现分子量在100～2800Da的乳清蛋白多肽清除自由基能力最强,对DPPH、羟基和超氧阴离子自由基的清除率分别为58.67%、65.67%和69.87%。Hernãndez等比较了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和CorlosePP水解β-乳球蛋白和α-乳白蛋白后的抗氧化活性,发现CorlosePP的酶解产物具有较强的自由基清除活性,分子量小于3kDa的组分是主要的抗氧化活性组分,进一步研究发现乳清蛋白组分延迟脂类氧化的能力与组氨酸和疏水性氨基酸的存在有关,其中Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ser-Asp-Ile具有比BHA更高的抗氧化活性。彭新颜等采用碱性蛋白酶酶解乳清蛋白,通过测定水解物对卵磷脂脂质氧化体系的硫代巴比妥酸值(TBARS)抑制作用、过氧化值(PV)的抑制作用、亚铁还原能力、金属离子螯合能力、DPPH自由基清除能力,发现底物浓度为5%、蛋白酶的添加量为2%、水解时间为5h条件下获得的乳清蛋白水解物具有最强的抗氧化能力。进一步研究表明酶解物的抗氧化活性与某些特征氨基酸序列存在着一定相关性,但还未有研究阐明具体构效关系。目前,对于乳清蛋白肽的抗氧化活性多通过体外方法检测,对于其抗氧化机制方面有必要通过细胞学实验和动物学实验从细胞和机体内两个水平上进一步深入研究。2.4乳清蛋白源的降血压肽高血压是心血管疾病的主要危险因素。血管紧张素转换酶(angiotensinconvertenzyme,ACE)是一种含Zn2+辅基的二肽羧肽酶,能够催化血管紧张素Ⅰ转变为血管紧张素Ⅱ,其存在于体内肾素-血管紧张素系统(reninangiotensionsystemun,RAS)和激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kininsystem,KKS)中,对血压的调节起着重要作用。ACE抑制肽是具有ACE抑制活性的多肽物质,一般由2～14个氨基酸组成,其抑制活性与其特殊的肽链结构密切相关。近年来,国内外对乳清蛋白源降血压肽的制备工艺、分离纯化、降压效果综合评价等方面进行了广泛研究。2007年,Ferreira等用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制备ACE抑制肽,并用RP-HPLC分离得到肽段ALPMHIR,该肽段是目前检测出的最有效的β-乳球蛋白衍生物ACE抑制肽。同年,Costa等研究了不同热处理温度和不同蛋白酶处理对乳清蛋白水解物降血压活性的影响,结果表明经过65℃变性处理后的碱性蛋白酶酶解产物在自发性高血压大鼠(SHR)体内具有最明显的降血压功效,而α-胰凝乳蛋白酶酶解产物虽然在体外具有最高的ACE抑制活性,但在体内只有经过腹腔给药后才能降低SHR动脉血压值,由此可见胃肠道消化酶会影响水解物中活性肽段的体内消化吸收。Lee等用蛋白酶K消化乳清蛋白并采用层析法分离得到6种对ACE具有抑制作用的肽类片段,分别为Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly、Gly-Lys-Pro、Ile-Pro-Ala、Phe-Pro、Val-Tyr-Pro和Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gin-Pro,它们主要来源于β-酪蛋白、β-乳球蛋白和乳铁蛋白等,对SHR具有明显的降压活性。序列分析结果显示,脯氨酸和缬氨酸可能是其发生作用的关键所在。Tsai等首次综合乳酸菌发酵法和酶法建立了一种制备乳清蛋白源降压肽的新方法,能有效提高活性肽的产量。经过SephadexG-15凝胶柱和RP-HPLC分离纯化后得到ACE抑制活性最高的肽段为Tyr-Pro-Tyr-Tyr,IC50值达90.9μmol/L,胃肠道能有效吸收,经动物体内实验证明其能有效降低SHR的舒张压(DBP)和收缩压(SBP),动力学方程研究结果表明该活性肽的ACE抑制模式是一种竞争性和非竞争的混合抑制模式。2.5乳清蛋白源血糖近年来,国内外已有大量的动物实验和人体临床实验表明乳清蛋白及其多肽具有明显的降血糖尤其是降低餐后血糖的功效,餐后血糖的异常升高是心脑血管疾病的危险因素之一。根据目前的研究进展,其可能的降血糖机制主要包括特殊氨基酸构成发挥降血糖效能、增加促胰岛素释放激素释放、提高胰岛素敏感性和增加腹饱感这四个方面。2009年,Petersen等对10名健康志愿者进行实验,发现乳清蛋白源血糖指数降低多肽(GILP)添加到葡萄糖饮料中经口服后能明显降低血糖指数,表明GILP能促进胰岛素分泌,且食品基质中蛋白和碳水化合物相结合能增强胰岛素反应。Gunnarsson等用乳清蛋白(WP)对雌性C57BL/6J小鼠进行灌胃(75mg/只),餐后2h内小鼠血糖明显降低,且小鼠血浆中葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(glucose-dependentinsulinotropicpeptide,GIP)和胰高血糖素样肽-l(glucagons-likepeptide-1,GLP-1)水平显著增加,而GIP和GLP-1能促进胰岛β细胞释放胰岛素而发挥降血糖作用。Blouet等研究表明用富含α-La营养混悬液喂食雄性Wistar大鼠,其餐后2h内其血糖明显低于其他蛋白配方饮食组大鼠的血糖,该研究中还表明增加摄入半胱氨酸或者添加α-LA都能抑制餐后血糖上升。Fird对14名Ⅱ型糖尿病患者进行实验,发现WP能降低其早餐后2h和午餐后3h内的血糖升高程度,此外,WP能增强Ⅱ型糖尿病病人餐后胰岛素反应,并提高血中GIP和GLP-1的水平。2.6醇肽的活性和作用相对于具有降血压、抗氧化等生理功能的食品蛋白源生物活性肽来说,降胆固醇食品蛋白源生物活性肽单体分离及其作用机理的研究相对较少。目前已有很多研究表明大豆食品源蛋白的酶解产物对动物血清胆固醇水平有较大影响,且主要集中于大豆蛋白和酪蛋白,而关于牛乳清蛋白源生物活性肽对血液胆固醇水平的影响的研究则相对较少。尽管如此,乳清蛋白源降胆固醇肽仍具有潜在的研究价值。Nagaoka通过小鼠实验表明,牛乳清蛋白源生物活性肽比大豆蛋白或酪蛋白具有更强的降低血液胆固醇的活性,并从β-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液中成功地分离出一种五肽IIAGLf(71-75),通过动物实验证明此肽能明显降低血清胆固醇水平,其活性甚至大于β-谷甾醇(一种降胆固醇药物)。Nagaoka还采用Caco-2细胞及活体动物实验研究了Ile-Ile-A1a-Glu-Lys影响胆固醇吸收的机理,结果表明Ile-Ile-A1a-Glu-Lys具有结合牛磺胆酸的能力和降低乳糜微粒胆固醇溶解度的作用。为了进一步评价乳清蛋白源降胆固醇肽的实体功效,高学飞于2006年通过动物实验证明经CM-SephadexC50层析分离得到的分子量在1000～12000Da的具有较高三羟基三甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeAreductase,HMG-CoA还原酶)抑制活性的乳清蛋白肽,不仅能显著降低血液中胆固醇、甘油三酯水平,减小动脉硬化指数,还具有促进生长、显著降低脂肪沉积的生物活性。3乳清蛋白及活性肽总之,乳清蛋白源生物活性肽来源于天然乳清蛋白,虽然在乳中的含量不高,但却具有极高的营养价值、食用安全性及生理保健功能,在促进机体的生长、发育和疾病防治等方面都起着重要的作用,可作为功能性食品或食品添加剂乃至药品应用到人们日常生活中。目前,市场上应用乳清蛋白及其活性肽的产品有:强化α-乳白蛋白或乳铁蛋白的婴儿配方奶粉、降低婴儿过敏反应的婴儿配方奶粉、添加了活性增长因子的医用配方营养奶粉、含有IgG或乳铁蛋白的防龋齿产品、在酸奶中添加乳铁蛋白的骨骼健康产品、促进蛋白质合成的营养运动产品以及添加降血压肽的发酵乳产品等。近年来国内外对乳清蛋白及其活性肽的生物学特性进行了广泛研究,越来越多的生物活性功能肽走进人们的视野,然而与日本及欧美发达国家已有的几十年研究经验相比,我国在这方面的研究起步较晚,随着现代分离、提取、检测技术的快速发展,对其研究必将日趋成熟和深入。乳清蛋白中潜在生物活性肽片段可以借助特定的酶或改变遗传性状的微生物释放出来,为其进