生物物理技术论文(新)

磁性纳米颗粒的体外细胞毒性评价方

法摘要：纳米颗粒能够渗透到膜细胞中，并沿神经细胞突触、血管和淋巴血管传播。与此同时，纳米颗粒有选择性地积累在不同的细胞和一定的细胞结构中。纳米颗粒的强渗透性为药物的使用提供了有效性，因此纳米材料在医学成像、疾病诊断、药物传输、癌症治疗、基因治疗等领域的应用越来越广泛，同时，纳米颗粒对人体健康的潜在威胁也备受关注，纳米毒理学研究由此应运而生。纳米材料往往影响细胞的代谢活动，细胞膜的完整性，细胞凋亡和增殖。本文就细胞经磁性纳米颗粒处理后出现的特征，总结了几种常用的毒性评价方法。关键词：磁性纳米颗粒；细胞毒性；检测方法目录TOC\o"1-5"\h\z引言1.针对线粒体功能障碍的检测21.1MTT法21.2CCK-8试剂盒法31.3AlamarBlue法42.针对乳酸脱氢酶泄露的检测（LDH法）43.针对细胞凋亡的检测（形态学观察）54.针对细胞坏死的检测（细胞膜不完整）54.1中性红染色54.2台盼蓝染色64.3乙酰氧甲基钙黄绿素和溴化乙锭65.针对DNA损伤的检测（彗星电泳法）6结论7.参考文献7引言随着科技的快速发展，纳米材料因其特殊物理化学特性而被广泛应用于化妆品、电学器件、染料、涂料及医药诊断等各个领域［1-3］，尤其在生物医药领域的作用及其显著，因此而备受关注，而人们对于纳米材料对环境安全和人体健康所潜在的影响却知之甚少。因此,纳米毒理学应运而生。纳米毒理学是专门研究纳米颗粒或材料毒性的学科,运用一系列方法来分析纳米材料在体内和体外所产生的影响［4］。一般利用体外细胞毒性实验来进行纳米材料的细胞毒性评价,与动物活体实验相比，体外细胞检测不会受道德上的束缚，更容易控制和复制，且花费不高。在研究纳米颗粒对细胞的毒性时，值得注意的是，细胞除了对被测试的潜在毒性剂的浓度波动敏感外，它们对所处环境中温度、PH、营养物和废弃物的浓度等的变化也很敏感。因此，为了确保检测的细胞死亡相对于不稳定的培养的条件，与加入的纳米粒子的作用相关，控制实验条件是非常重要的。此外，由于纳米颗粒可以吸附染料并具有氧化还原活性，采用合适的细胞毒性检测方法也很重要。所以需要进行重复检测，以确保得出正确的结论［5］。磁性纳米颗粒对细胞产生毒性影响导致细胞的变化有：炎症、凋亡小体的产生、线粒体功能障碍、膜破裂导致乳酸脱氢酶的泄露、活性氧的产生、DNA损伤、染色体的浓缩等［6］(图1)，本文就如何检测这些毒性作用导致出现的特征对磁性纳米颗粒的毒性检测方法作一简要综述,以供大家对纳米材料的细胞毒性进行评价时作为参考。OXhufkinniahciiSPIONGeoeratLOiiofR.OSJ「OHQJDNAdmageMembraneleakagebictaleOXhufkinniahciiSPIONGeoeratLOiiofR.OSJ「OHQJDNAdmageMembraneleakagebictale血hydro驴冶uChnamcficnnecotkki^LioiiLmpatreclimtoehondfialfiiucticnApaptoticbodies图1.纳米颗粒的细胞毒性反应针对线粒体功能障碍的检测1.1MTT法MTT比色分析法由Mosmann在1983年首创。MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中(图2),而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMS0)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比［7］。MTT法被广泛用于评价多种纳米材料的体外细胞毒性。Morteza

等用此法检测到不同浓度SPION处理下心脏细胞，脑细胞，肾细胞数量的变化（图3）[8]这种方法有很多优点，灵敏度高，简单，快速又简单，但是同时也有诸多缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。生成的甲瓒不易充分溶解。测试后的细胞不能继续培养。图2.线粒体中的琥珀酸脱氢酶使MTT还原为蓝紫色结晶甲臜1.2CCK-8试剂盒法CellCountingKit-8简称CCK-8,是一种基于WST-8的广泛应用于细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体的脱氢酶还原成橙黄色的formazan，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，不需要裂解细胞，可直接进行比色。细胞毒性越大，则颜色越浅。颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。此方法与MTT相比有明显的优点，首先，MTT被线粒体内的脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要特定的溶解液来溶解，细胞不可以重复使用，而WST-8和MTT类产品如XTT、MTS等产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的更易溶解。用CCK一8法检测后细胞可重复利用，将细胞用生理盐水洗2遍，加入培养液可继续培养进行传代，还可进行染色和组化实验等，而MTT法不具备这一功能［9］。总之，CCK一8法显色时间短、操作简便、灵敏度高、重复性好，而且检测后的细胞可重复利用，具有一定的实用性，可以替代MTT法并广泛应用。1.3AlamarBlue法Alamar-Blue检测试剂为细胞毒性检测提供了一种简便、快速、可靠、安全的方法，适用于高通量检测实验。此试剂的主要成分是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，其吸收峰为530—560nm。在细胞增殖过程中，细胞内NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，处于还原环境。摄入细胞内的染料被这些线粒体酶还原后释放到细胞外并溶于培养基中，使培养基从无荧光的靛青蓝变成有荧光的粉红色。最后用普通分光光度计或荧光光度计进行检测吸光度和荧光强度与活性细胞数成正比。Alamarblue法对细胞的毒性小，对样品破坏小、试剂用量少、操作简单，特异性高、灵敏度高、重复性好。具有加入培养液里的细胞生存力不受影响而使培养可以持续进行等优点。Alamarblue法比传统的细胞计数法和MTT可更准确地测定细胞的增殖反应，且能避免人为操作造成的试验误差，提高了试验结果的准确性和重复性，方法安全、简单、快速［10］。针对乳酸脱氢酶泄露的检测（LDH法）LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，正常情况下,LDH不能透过细胞膜，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外。此时培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比。LDH可使乳酸脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT）,INT接受H+被还原成紫红色甲臜类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定u。用此法检测了超顺磁性纳米颗粒等不同纳米颗粒对PC12细胞后细胞活力的变化［12］（图4）。此法测定迅速,并且能够进行定量分析。但是乳酸脱氢酶是大分子,只有靶细胞膜完全被破坏后才能释放出来，不能较早的反映细胞的存活状况。影响因素较多，例如，培养基、测定环境的温度、pH、反应时间等［13］。

(农一却二(农一却二s«>EMVtBa;工0JEndoVSOPVSOP(25DM9F撫ml)[250阳Fe/ml)HOOpgFe/ml)图.4不同纳米颗粒对PC12细胞处理后的细胞活力变化针对细胞凋亡的检测（形态学观察）纳米颗粒的细胞毒性可促进细胞的凋亡，细胞凋亡后细胞膜仍完整，通过普通光学显微镜下可观察到贴壁生长的凋亡细胞皱缩、圆化，细胞的体积变小常可见胞膜发泡的现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。在荧光显微镜下，吖啶橙染色后，活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光,胞质呈橘红色荧光，而凋亡细胞核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧（图5）。透射电镜下可观察到细胞凋亡时特征性的超微结构改变，如凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩，表面微绒毛消，核染色质凝聚、边缘化，呈新月形［14。］图.5凋亡细胞的荧光显微图像针对细胞坏死的检测（细胞膜不完整）4.1中性红染色中性红的摄入能力可以用来检测细胞增殖或细胞毒性。中性红不带电荷，可以被活细胞所摄入，并在溶酶体中积累。在细胞增殖加快时，细胞数量增多，可以摄入的中性红的量就会增加。在细胞受到损伤时，中性红的摄入能力会下降。这样通过对于中性红摄入量的不同就可以确定细胞的增殖或毒性情况，它在540nm出有较高的吸收值。中性红同时也是一种pH指示剂，在酸性时呈红色，在pH6.8升至pH8.0时由红色逐渐转变为黄色。细胞核中的核酸呈酸性，因此细胞核会被染成红色。由于溶酶体(lysome)中也是酸性环境，因此溶酶体也可以被中性红染色液染成红色。台盼蓝染色台盼蓝是带电荷的分子，不能进入正常的胞膜结构完整的活细胞；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，台盼蓝就会进入细胞，将细胞染成蓝色，并且在605nm波长处有较强的吸收。通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。用此方法检测细胞毒性，可重复性好。乙酰氧甲基钙黄绿素和溴化乙锭该法包含两种化学物质，乙酰氧甲基钙黄绿素和溴化乙锭。乙酰氧甲基钙黄绿素，是电中性的酯分子，可以通过扩散进入细胞，一旦进入细胞就会被酯酶转化为带绿色荧光的钙黄绿素分子。相反，若细胞损坏或死亡，本身不能渗透进入细胞的溴化乙锭与核酸结合，可激发发红色荧光，在495nm出激发，乙酰氧甲基钙黄绿素和溴化乙锭分别在515nm、635nm荧光信号最明显。针对DNA损伤的检测(彗星电泳法)彗星电泳技术,即单细胞凝胶电泳(Singlecellgelelectrophoresis,SCGE),可用于观察单个细胞DNA的损伤。比技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解、碱化处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大(图6)。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析，这是一种快速简便的毒性检测法［15。］•HMdDMA97.54%•HmJDNA83.25%HeadDMA6S.59%HeadOMa23,36^*图6.荧光显微图像结论大量研究表明，多种纳米颗粒显示其细胞生物毒性效应，因而纳米材料的细胞生物毒性效应研究工作广泛开展，但是其细胞毒性评价方法仍有缺陷，对于纳米材料的安全性评估还很不完善。纳米颗粒的毒性效应与纳米颗粒的粒径、比表面积、晶体构象、暴露计量以及暴露方式有关，因此在完善纳米材料毒性评估方法的同时，研究重点还要放在如何通过化学修饰保持纳米材料的优越性又避免其毒性效应，使其更为安全、广泛地应用于各个领域。参考文献1.Han,J.Y.,Z.T.Yu,L.Zhou.TheEffectsofDifferentHydroxyapatite/TiO2CompositeCoatingsonProteinExpressionofOsteoblast.inMaterialsScienceForum.2009.TransTechPubl.Lee,Y.J.,D.S.Ruby,D.W.Peters,B.B.McKenzie,J.W.P.Hsu,ZnOnanostructuresasefficientantireflectionlayersinsolarcells.Nanoletters,2008.8(5):p.1501-1505.Oberd6rster,G.,A.Maynard,K.Donaldson,V.Castranova,J.Fitzpatrick,K.Ausman,J.Carter,B.Karn,W.Kreyling,D.Lai,Principlesforcharacterizingthepotentialhumanhealtheffectsfromexposuretonanomaterials:elementsofascreeningstrategy.ParticleandFibreToxicology,2005.2(1):p.8.Marquis,B.J.,S.A.Love,K.L.Braun,C.L.Haynes,Analyticalmethodstoassessnanoparticletoxicity.Analyst,2009.134(3):p.425-439.Lewinski,N.,V.Colvin,R.Drezek,Cytotoxicityofnanoparticles.Small,2007.4(1):p.26-49.Singh,N.,G.J.Jenkins,R.Asadi,S.H.Doak,Potentialtoxicityofsuperparamagneticironoxidenanoparticles(SPION).NanoRev,2010.1.Mosmann,T.,Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.JImmunolmethods,1983.65(1-2):p.55-63.Mahmo