海洋活性多肽的研究进展

海洋活性多肽的研究进展

海洋生物活性物质是现代生物学的热点，自然海活性物质是海洋活动物质研究的重要组成部分。由于海洋生物的生活环境与陆地生物迥异,海洋生物具有多样性、复杂性和特殊性,从而使源于其中的海洋天然产物与陆地天然产物不同,这为寻找新的天然活性物质提供了丰富的物质来源。生物活性多肽是具有特殊生理活性的肽类,按其来源可分为天然存在的活性肽、蛋白酶解活性肽以及化学合成的活性肽。自1902年,伦敦大学医学院的Bayliss和Starling第一次发现活性多肽物质——促胰液素(secretin)以来,人们对多肽的研究逐渐深入,并且发现了数万种的生物活性多肽,其中有近百种多肽作为药物进行生产。为人类抵御疾病作出了重大贡献。从目前研究的情况来看,海洋天然活性多肽的研究主要集中在海绵、芋螺、海葵、海藻等少数几种海洋生物中。作用也十分明确:抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等。尽管大量的活性多肽已经从海洋生物中分离得到,但其中仅有少部分可作为药品进行开发进入市场,相当多的新化合物作为先导化合物,为新药的研究提供线索;还有一些海洋活性多肽在生物体内的含量很少,所以在其生理活性和结构确定后,采用全合成和固相合成的技术实现其产业化生产。本文就近年来海洋活性多肽的研究进展作一综述。1活性肽的分离和合成近年来,许多科学家致力于从深海细菌、真菌、微藻以及海洋软体动物中分离活性肽,并且取得了很大进展。这些活性肽结构复杂多样,参与生物体的重要生命活动,具有重要的基础研究及临床应用价值,是一类非常重要的新药来源。1.1抗结核杆菌活性的比较有些生物体在受到外界环境刺激时产生大量具有抗菌活性的阳离子多肽,从而使其具有天然免疫力。目前,已有百余种抗菌肽被分离,有些抗菌肽不仅具有很强的杀菌能力,还能杀死肿瘤细胞。这些海洋多肽类化合物的发现为寻找新的抗生素提供了线索。1996年,Hamann,M.T.等报道了从SacoglossanMulluskElysiarufescens。与KahalalideF不同,KahalalideA(图2)则未表现出明显的细胞毒性,但是该化合物具有极强的抗结核杆菌的活性,在浓度为12μg·mL-1时,对结核杆菌M.tuberculosis(H37Rv)的抑制率为83%,是迄今为止发现的第3个具有抗结核杆菌的活性的海洋活性多肽,值得进一步研究。1997年,Gerard,J.等报道了2种环状缩醛肽:MassetolideA和Viscosin,二者都有很强的抗结核杆菌的活性。前者是从海洋微藻中分离的假单胞杆菌属菌株中提取得到的,最小抑菌浓度MIC为2.5～5μg·mL-1,后者是从1种管状蠕虫中分离得到,最小抑菌浓度MIC为5～10μg·mL-1。2001年,ToddBarsby等从新几内亚海洋微生物枯草杆菌属的菌株中分离得到1种多肽类的抗生素BogorolA,该化合物能够对万古霉素耐药肠道球菌(VRE)和青霉素耐药金黄色葡萄球菌(MRSE)产生抵抗作用。1.2laxaphicinsa和依代尔的细胞毒性研究许多存在于海洋生物体内的化合物具有显著的细胞活性,为寻找抗肿瘤药物开辟了新途径。1987年,Pettit等首次从海兔(Dolabellaauricularia)体内分离得到由4个氨基酸组成的线性小肽Dolastatin-10,该化合物通过抑制微管聚合,对人乳腺癌、非小细胞性肺癌有显著疗效,具有良好的前景。目前,美国国家癌症研究所(NCI)与基诺药厂(Knoll)合作,该药正进入临床I期研究阶段。近几年,Dolastatin-10的结构类似物DolastatinH和IsodolastatinH相继被发现,并且也显示出较强的抗肿瘤活性。1997年,IsabelleBonnard等从海洋丝状藻青菌(Lyngbyamajuscula)中分离得到一系列具有细胞毒性和抗菌活性的环状脂肽,其中最主要的2种化合物LaxaphycinsA和B都具有非同一般的抗真菌和细胞毒性的生物协同作用,药理实验表明,LaxaphycinsA单独用药对细胞株的作用不大,几乎无活性,而LaxaphycinsA能够潜在地提高LaxaphycinsB的活性,加入1μmol/L的LaxaphycinsA,LaxaphycinsB对人体淋巴母细胞的IC50值降低3倍。表1列举了目前制药公司、癌症研究所及多所大学,正在研究的多种从海洋生物提取的抗癌化学成分,其中一些很有希望成为药物。1.3papuamicasid的海洋活性多肽1999年,PaulW,Ford等从新几内亚海域采集的海绵(TheonellamirabilisandTheonellaswinhoei)分离得到4种新化合物PapuamidesA,B,C,D,均为环状缩醛肽,并且是首次发现分子结构中含有3-羟基亮氨酸和同型脯氨酸残基的海洋活性多肽。PapuamidesA,B能够抑制体内由HIV-ⅠRF引起的T-淋巴细胞感染,在体外的有效浓度EC50为3.6ng.mL-1,PapuamidesA对癌细胞也具有细胞毒性,其IC50为75ng.mL-1。2001年,MohammadA.Rashid.等从印度尼西亚海绵(Sidonopsmicrospinosa)中分离得到一种新型的环状缩醛肽Microspisamide,由13个氨基酸残基组成,其中含有一个β-OH-BrPhe残基,这是以前所发现的海洋多肽中从未见过的。该化合物能够抑制由HIV-Ⅰ感染引起的细胞病变。1.4关于芋螺毒素的结构海洋生物中存在种类众多的肽类毒素,这些毒素性质独特,在生物医学、分子生物学的研究和应用方面有广阔的前景。目前研究较多的有芋螺毒素、海葵毒素,其它的海洋生物毒素如水母毒素、章鱼毒素、海胆毒素、海蛇毒素、海兔毒素、微囊藻素等报道的较少。芋螺毒素(ConotoxinCTX)是一类有10～30余个氨基酸残基组成的小肽,含有2对或3对二硫键,是迄今发现的最小核酸编码的动物神经肽毒素。芋螺毒素结合在神经和肌肉的受体上,具有高亲和力和高度专一的特点,是神经科学十分有效的探针。临床上用作特异诊断试剂,作为镇痛药具有疗效确切、不成瘾的特点。多种芋螺毒素已申请国家专利。1998年,England等从地纹芋螺(Conusgeographus)中分离得到δ-CTXGVⅢA,它是富含Gly和Thr的41肽,是迄今发现的芋螺毒素中分子最大的一个。进一步的研究表明第34位为极为罕见的L-6-Br-色氨酸,是该毒素的功能决定因子。海葵毒素(AnthoplerintoxinAP)也是研究的热点,是一类分子量范围为3000～6000,由2～3个二硫键交联着的单链碱性分子,其一级结构可分为3种类型。但以后分离出来的calitoxin,BTTXⅡ和AEXⅡ,AEXⅢ与经典的3种类型有较大不同,代表着新颖结构类型的海葵毒素多肽。海葵毒素主要特异结合在心脏Na+通道上,是一类非常有价值的钠通道研究工具药。1.5激肽释放酶功能1997年,GaryP.Richards等黑海鱼(Centropristisstriata)骨骼肌纤维中分离得到一种鱼类激肽释放酶原Prokallikrein。激肽释放酶kallikreins在鱼体内有多种功能,首先它能够促使酶激活荷尔蒙和生长因子而调节鱼的生长发育;再次它能够分裂激肽源底物释放出激肽,而激肽通过放松血管平滑肌,增加血管紧张素,提高血管通透因子的活性来调整血压,同时激肽能够增强鱼类精子活力。所以激肽释放酶原Prokallikrein的发现为研究激肽释放酶kallikreins对鱼类健康和疾病的影响提供了新的研究思路。2鱼类蛋白质资源的优化利用及酶活性多肽的使用天然存在的海洋活性多肽由于在生物体中含量低,而且提取困难,难以实现大量生产供给所需,化学人工合成多肽成本昂贵。所以,人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物获得活性多肽这条途径上来。由于海洋生物生存的环境与陆地生物完全不同,如高压、低温、高温和高盐等极端环境,为了适应这些极端的海洋生物环境,海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成还是氨基酸的序列都与陆地生物蛋白有很大的不同,同时,海洋生物蛋白资源无论在种类和数量上都远远大于陆地蛋白资源,并且未得到很好的开发。种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中,潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列,用特异的蛋白酶水解,就释放出有活性的肽段。海洋生物蛋白资源是21世纪人类重要的蛋白类食物及生物活性物质的重要来源。我国目前的海洋生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅,但我国目前的蛋白类水产品中,除一部分直接食用外,大部分通过简单的加工技术制成食品进入市场,加工技术落后,产品结构单一,产品的附加值低,使得产品在国际市场上的竞争力较差。因此,我国急需对海洋生物蛋白资源进行优化利用和高值化加工。1979年,Oshima等首次报道了利用细菌胶原酶水解凝胶并从其水解物中分离出6种降血压肽,此后,利用酶工程技术,从其它食品蛋白质中分离的降血压肽相继出现,这些肽在体外有抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性,在体外有明显的降血压作用。近年来,从海洋鱼类及其它水产品中发现的降压肽见表2。在天然降血压肽的结构与功能的关系研究中,一般认为若肽C末端是Pro,Phe,Tyr或序列中含有疏水氨基酸则有较高活性。对于二肽,若N末端为甘氨酸残基时,其对ACE的抑制作用可因C末端不同而相差300倍,C末端为Tyr,Trp,Pro则有较强的抑制作用。若C末端为甘氨酸残基时,其对ACE的抑制作用可因N末端不同仅相差16倍,其中N末端为Val,Ile,Arg是最有效的。最强的ACE抑制二肽Val-Trp比最弱的ACE抑制二肽Pro-Gly抑制作用高10000倍。这说明ACE与底物或竞争性抑制剂的氨基酸残基结合有高度的专一性。2000年,RozennRavallec-Plé等利用商品酶Alcalase○R(NovoNordisk,Nanterre,France)对鳕鱼肉进行水解,得到高品质的鱼蛋白水解物(FPHs),水解产物中含有细胞生长因子、促分泌素(胃泌素和缩胆囊素)等。2001年,RozennRavallec-Plé等利用同一种酶Alcalase○R对加工沙丁鱼的废弃物进行水解,得到了多种生物活性多肽:胃泌素、降钙素基因相关肽(CGRP)、细胞生长因子等。目前,大多采用陆地酶工程技术应用于海洋蛋白酶解活性肽的研究,如中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。但是由于陆地生态环境与海洋生态环境有很大差异,海洋蛋白的氨基酸序列和组成与陆地蛋白源也存在很大差别。所以,陆地酶制剂可能无法高效用于海洋蛋白的酶解。因此,应该从海洋生物体内、海水及海洋污泥中分离、纯化可高效酶解不同海洋蛋白的蛋白酶原。3海洋活性肽的开发目前,国内外研究和开发的活性多肽主要来源于陆生动植物,如从牛乳提取的具有免