第2节第2课时动物细胞融合技术与单克隆抗体

第2课时动物细胞融合技术与单克隆抗体学有目标——课标要求必明记在平时——核心语句必背1．阐明动物细胞融合技术的概念，举例说出诱导动物细胞融合的方法。2．概述制备单克隆抗体的过程。3．认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。1．动物细胞融合常用的诱导方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法。2．杂交瘤细胞是由经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合而成的，具有既能无限增殖又能产生专一抗体的能力。3．制备单克隆抗体过程中第一次筛选是为了获得杂交瘤细胞，第二次筛选是为了获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。4．单克隆抗体最主要的优点是特异性强、灵敏度高，并可大量制备。[主干知识梳理]一、动物细胞融合技术1．概念：使

结合形成一个细胞的技术。2．诱导原理和结果(1)诱导原理：

。(2)诱导结果：形成

细胞。两个或多个动物细胞细胞膜的流动性杂交3．诱导方法：

法、电融合法和

法等。4．意义：突破了

的局限，使

成为可能。5．动物细胞融合技术的应用(1)成为研究

、

、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(2)用于制备

。PEG融合灭活病毒诱导有性杂交远缘杂交细胞遗传细胞免疫单克隆抗体二、单克隆抗体及其应用1．制备原理(1)B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。(2)骨髓瘤细胞特点：能在体外大量

。(3)杂交瘤细胞特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能__________又能产生大量

。增殖无限增殖特定抗体2．制备过程3．单克隆抗体的优点能准确地识别___________________，与特定抗原发生特异性结合，并且可以____________。4．单克隆抗体的应用(1)作为

，具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于

和

。抗原的细微差异大量制备诊断试剂治疗疾病运载药物[边角知识发掘]1．(教材第48～49图2­16拓展训练)观察制备单克隆抗体过程的示意图，将①～⑥名称序号填写在下图对应的方框内。①体内培养单抗②体外培养单抗③注射特定抗原④抗体检测呈阳性⑤诱导融合⑥用特定的选择培养基进行筛选答案：A.③

B．⑤

C．⑥

D．②

E．④

F．①2．(教材第50页“思考·讨论”延伸思考)抗体药物偶联物(antibody—drugconjugates，ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。据此分析：ADC在临床应用上的作用机理是什么？提示：其作用机理是通过单克隆抗体的靶向作用特异性地识别肿瘤细胞表面的抗原，然后利用细胞本身具备的内吞作用使化学药物进入肿瘤细胞体内发挥药力，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。[教材问题提示]一、旁栏思考题(教材第49页)病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。二、思考·讨论(教材第50页)1．ADC的抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。2．可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。3．单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和重复利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。4．单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面，可结合搜集的资料和教材相关知识制作。(略)[师说重难]

一、动物细胞融合的原理与过程1．原理：细胞膜的流动性。2．过程：动物细胞融合的过程包括细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合。其中细胞膜融合是细胞融合的先导，在细胞膜融合中体现出细胞膜具有一定的流动性，细胞融合的实质是核融合。动物细胞融合完成的标志是两个或多个细胞核融合为一个细胞核。如下图(以灭活的病毒诱导为例)：3．结果：形成单核杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。二、动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞的增殖融合前处理先除去细胞壁先使细胞分散开使用的酶纤维素酶和果胶酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶诱导手段物理法：电融合法、离心法化学法：PEG融合法除物理法和化学法外，也可用灭活的病毒诱导过程结果杂种植株杂交细胞应用培育植物新品种主要用于制备单克隆抗体意义克服了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合续表[在应用中悟][典例1]下列选项中关于动物细胞融合的说法，错误的是 (

)A．动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程B．动物细胞融合后形成的具有两个动物细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞C．常用的诱导动物细胞融合的方法有聚乙二醇、灭活的病毒诱导、电融合、紫外线照射等D．细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能[解析]

常用的诱导动物细胞融合的方法有物理法——电融合法、离心法等；化学法——聚乙二醇(PEG)、高Ca2＋­高pH融合法；生物法——灭活的病毒诱导。紫外线照射不是诱导动物细胞融合的方法。[答案]

C[典例2]下列关于动物细胞融合与植物体细胞杂交技术的说法，正确的是

(

)A．基本原理相同B．诱导细胞融合的方法相同C．细胞融合前的处理过程相同D．融合后都需要进行筛选[解析]

植物体细胞杂交的原理为细胞膜的流动性、植物细胞的全能性，而动物细胞融合利用的是细胞膜的流动性和细胞增殖，A错误；动物细胞融合常用灭活的病毒诱导，而植物体细胞杂交不能，B错误；动物细胞融合前需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散开，植物体细胞杂交常用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，C错误；细胞诱导融合后会形成多种融合细胞，还有未融合的细胞，因此诱导动物细胞、植物体细胞融合后都要进行筛选，D正确。[答案]

D[在训练中评]1．下图表示用仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列相关叙述正确的是

(

)A．细胞a和细胞b必须为同种细胞才能融合B．细胞c同时有细胞a和细胞b的遗传物质C．该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性D．植物细胞的融合过程与动物细胞完全相同A解析：不同种的细胞也能融合，如人、鼠细胞融合，A错误；如题图所示，细胞a和细胞b融合成一个细胞，细胞c同时有细胞a和细胞b的遗传物质，B正确；该融合过程体现了细胞膜具有一定的流动性，C错误；植物细胞的融合通常要先去除细胞壁，其细胞融合的过程与动物细胞不完全相同，D错误。答案：B

2．一系列实验证明细胞膜具有流动性，荧光抗体免疫标记实验就是其中的一个典型例子。下图表示了人、鼠细胞融合的过程，研究中分别将带有绿色荧光、能与人体细胞膜上HLA抗原特异性结合的抗体和带有红色荧光，能与小鼠细胞膜上H2抗原特异性结合的抗体放入细胞培养液中，对人、鼠细胞进行标记。下列有关该实验的叙述，错误的是 (

)A．要使实验现象明显，可以适当提高细胞培养液的温度B．选取不同生物细胞进行融合是因为不同生物细胞表面抗原差异较大C．实验表明不同种生物细胞可以杂交，而同种生物细胞不能进行融合D．实验结果可以直接证明细胞膜上的蛋白质分子可以运动解析：细胞膜的流动性与温度有关，因此为了使实验现象明显，可适当提高温度，加速细胞膜流动，A正确；由于采用了免疫荧光标记法，而同类生物细胞膜上的蛋白质相似程度很大，因此难以找到特异性蛋白，采用异种生物细胞可以达到这一目的，B正确；由于不同细胞的细胞膜结构基本相似，因而同种或不同种生物细胞均可以相互融合，C错误；细胞膜融合实验表明了细胞膜的磷脂分子与蛋白质分子均是可以运动的，D正确。答案：C

2．细胞内DNA的合成一般有两条途径，主要途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基蝶呤可以阻断此途径。辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶的催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。如何利用DNA合成途径不同的特点配制培养基筛选出杂交瘤细胞？请说明原理。提示：在培养基中加氨基蝶呤就可以筛选出杂交瘤细胞。因为培养基中加入氨基蝶呤后，骨髓瘤细胞和两两融合的骨髓瘤细胞由于其唯一的DNA合成途径被抑制而不能增殖。B淋巴细胞和两两融合的B淋巴细胞不能增殖，只有杂交瘤细胞可通过辅助途径合成DNA进行增殖。[师说重难]

1．血清抗体与单克隆抗体的比较名称产生特点血清抗体由B淋巴(浆)细胞分泌一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强、灵敏度高，能大量制备2.单克隆抗体制备的过程3．制备单克隆抗体过程中的两次筛选项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞从小鼠体内提取的B淋巴细胞有很多种，形成的杂交瘤细胞也有很多种筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞4.单克隆抗体制备过程的关键分析(1)对动物免疫的原因：B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以，与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。(2)杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质，不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力，还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力，从而可以克服B淋巴细胞不能无限增殖的缺点，大量生产单克隆抗体。[在应用中悟][典例1]

(2021·山东高考)一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。下列说法正确的是

(

)A．注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大B．单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合C．利用该小鼠只能制备出一种抗p72的单抗D．p72部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况[解析]单抗的制作需要筛选，而多抗不需要筛选，抗原纯度越高，产生的多抗纯度越高，因此抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响小，A错误；单抗制备过程中通常将分离出的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，B错误；非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72上有多种抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，所以向小鼠体内注入p72后，可以刺激小鼠产生多种抗p72的单抗，C错误；p72部分结构改变只改变了部分抗原决定簇，因此由这部分抗原决定簇产生的抗体失效，但由于还存在由其他抗原决定簇刺激机体产生的抗体，所以多抗仍有效，D正确。[答案]

D[典例2]如图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT－)，在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述错误的是

(

)A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础[解析]

诱导动物细胞融合的方法有灭活病毒诱导法(如仙台病毒)、PEG融合法、电融合法等，A正确。两两融合的细胞包括：免疫B细胞与免疫B细胞的融合、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合、免疫B细胞与骨髓瘤细胞的融合，其中骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，不能在HAT培养液中生长，B错误。杂交瘤细胞还需要进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选才能用于生产，C正确。细胞融合的基础是细胞膜的流动性，D正确。[答案]

B[在训练中评]1．下列有关单克隆抗体制备及其应用的叙述，错误的是 (

)A．制备单克隆抗体运用的技术有动物细胞培养和动物细胞融合B．需要用选择培养基筛选杂交瘤细胞C．需要从杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的细胞D．利用“ADC”治疗癌症就是利用了单克隆抗体清除癌细胞的特性解析：制备单克隆抗体需要运用细胞培养技术培养B细胞、骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞等，需要运用细胞融合技术将B细胞与骨髓瘤细胞融合，A正确；由于B细胞与骨髓瘤细胞融合时，有未融合的细胞，也有同种融合的细胞，这些不符合筛选要求的细胞都需要通过选择培养基淘汰，B正确；筛选到的杂交瘤细胞必须是既能无限增殖，还能产生特定抗体的细胞，C正确；“ADC”通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，借助单克隆抗体的导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞，D错误。答案：D

2．如图为利用小鼠制备单克隆P抗体的过程，图中HAT培养基为选择性培养基，只有杂交瘤细胞能在该培养基中存活。据图分析，下列说法错误的是

(

)A．获取B淋巴细胞前需要给小鼠注射P抗原B．加入的聚乙二醇可促进B细胞和鼠瘤细胞融合C．细胞集落①②③④为单个鼠瘤细胞的克隆D．细胞集落①能无限增殖且产生P抗体解析：获取B淋巴细胞前需要用P抗原注射小鼠，用于产生相应的效应B细胞，A正确；聚乙二醇能促进细胞融合，故加入的聚乙二醇可促进B细胞和鼠瘤细胞融合，B正确；在HAT培养基中，只有杂交瘤细胞能存活，因此细胞集落①②③④为单个杂交瘤细胞的克隆，C错误；用P抗原进行检测，细胞集落①抗原抗体反应呈阳性，说明细胞集落①既能无限增殖，又能产生P抗体，D正确。答案：C

科学探究——杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养用选择培养基(HAT)筛选出的杂交瘤细胞大多数不能分泌抗体，仅有少数细胞能分泌所需的特异性抗体，因此需要将这些杂交瘤细胞挑选出来。如何挑选呢？可以根据抗原与抗体特异性结合的原理，运用免疫酶测定法(如常用的酶联免疫吸附法)、免疫荧光技术、放射免疫测定法等检测各孔上清液中细胞分泌的抗体。一般杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时进行检测(对小鼠的杂交瘤细胞来说，一般在融合后的1～14d进行检测)。另外，新融合的杂交瘤细胞不稳定，容易失去分泌抗体的性质，所以一般需要进行多次检测以确保其稳定性。当经过2～3次检测证实在培养孔中存在特异性抗体时，就可以对杂交瘤细胞进行连续克隆化培养了。克隆化是指由单个细胞分裂增殖获得细胞团的培养过程。常用的克隆化培养方法包括有限稀释法、软琼脂培养法等。下面以有限稀释法为例进行简要说明：将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释，使分配到96孔细胞培养板每个孔中的细胞数不超过1个，通过培养让它增殖为单克隆。一般培养4～5d后，如果在倒置显微镜下见到一簇紧密生长的细胞，可认为这是单一克隆。经过一次克隆化培养的细胞不能保证其来自单个细胞，一般经过3～4次培养才可以获得稳定的单克隆，这时如果再次检测抗体为阳性，就可以进行大规模生产了。[素养评价]1．下图所示为几项生物工程技术综合实验研究的流程图。下列相关叙述错误的是

(

)A．整个流程运用的生物技术有动物细胞培养以及细胞融合等B．过程①是诱导干细胞中的基因选择性表达的结果C．过程②得到的Z细胞还需要进行克隆化培养和抗体检测及多次筛选D．过程②中需用纤维素酶处理解析：过程①③涉及动物细胞培养，过程②涉及细胞融合，A正确；过程①为诱导干细胞增殖分化为各类细胞，细胞分化的实质是基因的选择性表达，B正确；X细胞相当于能无限增殖的骨髓瘤细胞，Y细胞是能产生抗H1N1病毒抗体的B淋巴细胞，则二者融合后的Z细胞相当于杂交瘤细胞，需要对其进行克隆化培养及多次筛选，C正确；过程②中利用PEG融合法、电融合法或灭活病毒诱导法来诱导细胞融合，D错误。答案：D

2．下面是单克隆抗体制备过程示意图