高效液相色谱法同时测定不同产地醋莪术饮片中4种成分

高效液相色谱法同时测定不同产地醋莪术饮片中4种成分

姜科姜黄属植物的蓬莪术c.kwasinsi类和ii类。g.leeetc.f.liang和wenyuni不在乎。h.chen等人的干燥根系主要产于四川、广西和浙江。醋莪术为莪术饮片经醋炙后得到的合格饮片,其主要含有挥发油(1%~2.5%)和姜黄素2大类成分。挥发油中主要成分为单萜和倍半萜类,如莪术二酮、莪术醇、吉马酮和β-榄香烯等。莪术醇在2005年版和2010年版《中国药典》中作为含量鉴别的指标已有广泛研究,莪术常用的含量测定方法有:分光光度法、气相色谱法、毛细管气相色谱法。孙艳涛等采用HPLC波长切换法测定了莪术残油(去除β-榄香烯的挥发油)中莪术二酮、莪术醇和吉马酮的含量,李敏等采用HPLC法测定了郁金类药材中吉马酮和莪术二酮的含量,冯海红等采用气相色谱法测定了不同品种莪术中β-榄香烯的含量,在现有文献报道中,有关莪术的化学成分研究主要集中于生药、生饮片和莪术油,莪术炮制品如醋饮片研究报道较少,而中医临床上应用较多的是醋莪术饮片。因此同时分析检测醋莪术饮片中莪术二酮、莪术醇、吉马酮和β-榄香烯这4种有效成分的含量对醋莪术饮片及其制剂的质量标准建立和临床应用都有重大的意义。1药品、成分配比及样品来源Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)包括:四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器;依利特HypersilODS2柱(4.6mm×250mm,5μm)(大连依利特分析仪器有限公司)。莪术二酮对照品(上海沪云医药开发有限公司,批号13657-68-6),莪术醇对照品(中国药品生物制品检定所,批号100185-200506),吉马酮(牻牛儿酮)对照品(中国药品生物制品检定所,批号111665-200902),β-榄香烯对照品(中国药品生物制品检定所,批号100268-200401)。样品:取购自莪术主产地(四川、广西、浙江),经南京中医药大学药学院巢建国教授鉴定为姜科植物蓬莪术C.phaeocaulis、广西莪术C.kwangsiensis及温郁金C.wenyujin的干燥根茎。生药材标本存放于南京中医药大学中药炮制实验室。分别取净莪术片按2010年版《中国药典》莪术饮片项下制法各产地相应的莪术和醋莪术饮片。样品来源及批次见表1。试剂:乙腈、甲醇为色谱纯,其他所用试剂均为分析纯。2方法和结果2.1腈a-水-腈ODS-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,乙腈(A)-水(B),0~30min,40%~60%A;30~40min,60%~80%A;40~60min,80%~90%A。下一个循环前用100%乙腈冲洗色谱柱10min,继续用40%的乙腈平衡10min。柱温25.0℃;流速1.0mL·min-1;检测波长214nm。2.2溶液的制备2.2.1混合对照品溶液的配制精密称取各对照品适量,置于10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,即得含莪术二酮0.2640g·L-1,莪术醇1.3670g·L-1,吉马酮0.0520g·L-1,β-榄香烯0.2531g·L-1的混合对照品溶液。2.2.2联合滤过滤滤称取莪术片粉末0.5g,精密称定,加乙醚超声提取3次,每次用量为10mL,时间为10min,合并滤液,用少量乙醚洗涤残渣及滤器,合并乙醚液,挥干乙醚,残渣加甲醇溶解并定容至10mL,摇匀,滤过,即得。2.2.3不同药物治疗吉马酮的情况精密吸取上述对照品储备液5mL,置于10mL量瓶中,甲醇定容至刻度,摇匀,重复此操作再连续稀释4次。最终使莪术二酮的质量浓度分别为0.2640,0.1320,0.0660,0.0330,0.0165,0.0083g·L-1;莪术醇为0.2136,0.1068,0.0534,0.0267,0.0133,0.0067g·L-1;吉马酮为0.0520,0.0260,0.0130,0.0065,0.0033,0.0016g·L-1;β-榄香烯为0.2531,0.1265,0.0633,0.0316,0.0158,0.0079g·L-1。2.3色谱条件同前处理分别取空白溶剂,混标溶液,样品溶液,注入液相色谱仪中,色谱条件同前,进样10μL,测定,结果表明莪术二酮、莪术醇、吉马酮和β-榄香烯分离良好,在各出峰处均无干扰,见图1。2.4线性范围与相关系数各对照品液分别进样10μL,重复2次,按2.1项下测定峰面积值,以峰面积平均值和对照品浓度进行回归处理,计算线性回归方程、线性范围和相关系数,见表2。2.5武德吉马酮、吉马酮、-榄香烯的检测取同一混合对照品储备溶液(莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯质量浓度分别为0.2640,1.3670,0.0520,0.2531g·L-1),连续进样6次,进样量10μL,测定莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯的峰面积值,计算得的RSD分别为0.73%,0.63%,0.78%,0.52%。2.6溶液稳定性测定取批号为100204的样品粉末0.5g,照供试品溶液的制备项下制备供试品溶液,隔2h进样10μL,进行测定,计算峰面积在12h内的RSD,结果莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯的分别为0.78%,0.51%,0.33%,0.57%,表明供试品溶液在12h内稳定。2.7样品检测及分析取批号为100204的样品粉末0.5g,精密称定,按供试品溶液制备项下方法制备样品,平行试验6份,在上述色谱条件下,进样量10μL,进行测定,计算莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯的峰面积的RSD,结果为2.1%,2.0%,2.8%,2.3%。2.8加样回收率试验精密称取9份批号为100204的莪术粉末0.25g,分别置于具塞锥形瓶中,再精密加入质量浓度为1.32g·L-1莪术二酮、1.068g·L-1莪术醇、0.3155g·L-1吉马酮、0.5062g·L-1β-榄香烯对照品溶液1.2,1.0,0.8mL(每个浓度取3份),照供试品溶液制备项下制备样品,注入液相色谱仪中,色谱条件同前,进样10μL,计算加样回收率。结果莪术二酮、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯的回收率分别为98.27%,97.96%,98.20%,97.27%,RSD分别为2.9%,1.5%,2.0%,2.7%。2.9供试品溶液的制备取18批醋莪术饮片样品(过3号筛)约0.5g,精密称定,按供试品溶液制备方法制备,得供试品溶液。并按上述含量测定方法分别测定其中4种成分的含量,见表3。3讨论3.1色谱条件选择作者比较了KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm);依利特HypersilODS2柱(4.6mm×250mm,5μm),分别采用同一色谱条件进行分离,结果表明依利特HypersilODS2柱,4种成分均能出峰,各峰间分离度、对称性较好,分离效果为佳。3.2相为乙腈a-水b分别采用不同梯度的流动相进行色谱分离。结果表明流动相为乙腈(A)-水(B),0~30min,40%~60%A;30~40min,60%~80%A;40~60min,80%~90%A。分离效果最佳。3.3醋酒中各化合物的含量在最佳提取制备条件摸索方面,作者对提取溶剂,提取方式及提取次数进行考察。发现采用乙醚超声提取,提取效果较好,且色谱峰峰形较好;实验中发现长时间超声提取会使提取温度升高,影响挥发性成分的含量测定,故控制超声提取时间为10min;样品提取至无色需要重复操作3次,故样品只提取3次。实验中样品使用乙醚作溶剂,以超声提取3次,每次用量为10mL,每次10min为宜。实验结果表明莪术经醋制后莪术二酮和β-榄香烯的含量明显下降,莪术醇的含量略微上升,吉马酮的含量略微下降。莪术二酮等4种成分均为萜类和倍半萜类化合物,熔沸点较低,炮制过程中的加热易造成这些成分的挥发,许志忠等研究发现莪术二酮在受热的条件下可以定量地转化为莪术醇,涉及一个热重排反应,且在相同条件下,莪术醇不能转化为莪术二酮,可能