中药治疗骨质疏松症实验研究进展

中药治疗骨质疏松症实验研究进展

骨质疏松症（op）是一种常见的代谢性骨病，以骨量减少和骨组织结构的退行性改变为特征，导致骨脆弱性增加，容易发生骨折。我国老年女性发病率高达90.5%,老年男性达60.7%。据预测,21世纪中期,我国老年人口总数将达4亿,OP发病人数可达2亿左右。OP除可发生在一些代谢内分泌疾病外,主要发生在绝经后妇女和老年人群中。骨质疏松症由于易发骨折和致畸、致残,是影响代谢性骨病患者和老年人生活质量的主要因素之一。因此,能更科学研究与开发安全、有效的中药及其复方成为OP防治药物,已是研究人员面临的一个十分重要的任务。1主要单味中药和有效成分外科细胞培养的实验研究1.1促进ob分化和分化的作用淫羊藿,又称仙灵脾,归肝、肾经,为补肾壮阳要药。淫羊藿通过抑制破骨细胞(osteoclast,OC)产生而降低骨吸收,从而达到抗OP的作用。淫羊藿苷能促进成骨细胞(osteoblast,OB)Ⅰ型胶原的表达和BGP的合成而具有刺激体外培养OB增殖、分化和矿化的功能。骨碎补,归肝、肾经。采用破骨OB共培养体添加不同浓度的骨碎补提取物后发现OC的移动性增加,有利于OB早期分化。其水提物和醇提物均可促进小鼠OB株MC3-E1增殖、分化和矿化作用,其机制可能是促进ARmRNA表达,与其拟雄激素效应有关,从而可抑制骨吸收和促进骨生成。从骨碎补提取的单体黄烷-3-醇类有促进人乳癌细胞MCF-7j及OBROSa7/28增殖作用,其作用强度超过雌二醇和染料木素,提示骨碎补中可能存在雌激素样化合物。山茱萸归肝、肾经。山茱萸水提液能提高OP模型小鼠(SAM-P/6)抗疲劳能力以及甲状旁腺素含量、骨密度等,给药组各项指标均较空白对照组有显著性差异,提示山茱萸水提液确实能明显改善SAM-P/6小鼠的OP状况。杜仲归肝、肾经。杜仲总黄酮可促进新生大鼠颅盖骨体外培养OB增殖。从杜仲叶提取分离出4个化合物,对体外培养的成骨样细胞增殖和代谢均有影响,都有一定的促进OB增殖、调节OB代谢的作用。续断具有补肝肾、强筋骨等作用。续断总苷可以促进OB的增生,促进OBALP分泌和促进OB增殖与分化的作用。蛇床子归肾经。蛇床子有效成分总香豆素以及其中的单体蛇床子素可对OB和OC的骨代谢进行调节,并对各种类型的OP模型具有一定的防治作用。1.2对骨的作用鹿茸具有壮肾阳,强筋骨等功效。目前未见有OP细胞培养的实验研究报告。鹿茸及鹿角胶对去卵巢大鼠OP症可显著提高去卵巢大鼠的骨密度、骨矿物质含量及BGP,降低ALP含量,对去卵巢所致的大鼠OP症具有拮抗作用。鹿茸总多肽(TVAP)可纠正维A酸所致骨重建的负平衡状态,使骨量增加,骨组织显微结构趋于正常,对大鼠OP有防治作用。葛根为豆科植物,其生物活性成分为葛根异黄酮,具有雌激素样作用。葛根异黄酮对新生SD大鼠的颅骨用胶原酶法培养OB的作用表明,葛根异黄酮可刺激OB增殖,提高碱性磷酸酶活性及矿化结节形成数量的作用。于世风还用新生兔长干骨培养的OC和鼠颅盖骨培养的OB观察葛根异黄酮对骨形成和骨吸收的调控作用。结果发现葛根黄酮可通过抑制骨吸收,刺激骨形成来调控骨代谢,其中抑制骨吸收的效果较强。丹参也有类激素样作用,丹参水提物对糖皮质激素造成大鼠骨质疏松和丹参素对体外培养的OB的作用研究显示,丹参水提物和丹参素均可促进大鼠颅骨成骨细胞ALP活性。还有前面提到的淫羊藿、骨碎补等也有类激素样作用。2中医药对骨质疏松症的实验研究2.1牡蛎钙时正离体对大鼠群众中bmp-4和smad6基因表达的调控中药复方制剂多数采用含药血清(血浆)进行骨细胞培养研究。用骨康(由补骨脂、淫羊藿、黄芪、肉苁蓉等组成)含药血清对大鼠成骨细胞BMP-2表达以及对成骨细胞OPG,RANKL分泌和鼠破骨细胞影响的研究表明,骨康可能通过促进BMP-2的分泌以及抑制RANKL分泌,上调OPG分泌和直接抑制破骨细胞而达到治疗骨质疏松症的目的。用牡蛎钙补肾中药血清研究对大鼠成骨细胞中骨形成蛋白-4诱导成骨信号转导机制的调控作用。结果证明牡蛎钙补肾中药血清可以提高OB中BMP-4和Smad5基因表达、降低Smad6基因表达,是其防治骨质疏松症的重要机制之一。此外,还有益骨汤、仙鹿健骨汤和壮筋续骨汤都用含药血清对成骨细胞蛋白mRNA、矿化结节等进行作用机制研究。2.2治疗非人体域性大鼠骨强度和骨力学性能补益肝肾为主的复方中药仙灵骨葆已经有了较系统的研究。仙灵骨葆对卵巢切除大鼠股骨骨折愈合有促进作用;对去卵巢骨质疏松大鼠的骨形态计量学研究表明BFR/BS,BFR/BV,BFR/TV均增加;对预防卵巢切除大鼠引起的髋部肌肉组织退化的作用研究表明仙灵骨葆可以降低骨骼源性和骨骼源性的骨质疏松,以及淫羊藿黄酮类成分预防去势大鼠的骨强度和骨质结构成分退化。妇疏宁丸(由熟地黄、枸杞、杜仲、黄芪、当归等组成)可明显增加去卵巢大鼠骨钙、骨磷含量,抑制去卵巢大鼠子宫质量降低及体重增加,具有明显成骨作用。二仙益骨汤(由仙茅、仙灵脾、骨碎补、杜仲、黄芪、白术等组成)可明显提高去势大鼠的骨密度、血清激素水平,并能改善治疗组大鼠的骨力学性能。中药骨康可增加去势或维甲酸造成骨质疏松模型大鼠骨密度。2.3抗去势op大鼠骨疏灵具有温阳、益气、活血功效,研究表明可促进成骨细胞增殖。正骨通痹丸具有驱湿活血理气等功效,抗去势OP大鼠作用机制与其抑制IL-6及TNF-α产生,促进骨形成,维持骨转换平衡有关。另外,具有补肾健脾活血功能的增骨丸,可提高去势大鼠血清及骨髓中的L-B的含量而达到防治OP的作用。3中医药对op症的实验研究存在问题和视角3.1骨细胞培养疗效试验3.1.1胞实验设计方面对OB的促进药物药效评价从文献研究分析,许多骨细胞实验设计欠合理,对OB骨形成促进药物应当采用单点法和多点法同时进行,对OB分化能力和矿化能力以及骨形成相关蛋白与细胞因子合成分泌能力都要进行测定。3.1.2bmp对成骨细胞分化的作用原代分离的成骨细胞多含有其他细胞,如成纤维细胞、软骨细胞等,为了排除干扰以及保证细胞群体均一性,较多采用的是成骨肉瘤细胞系,例OS-732,MG-63等。目前,来源于胎鼠颅骨的成骨前体细胞MC3T3-E1是一种单向成骨细胞分化的细胞系,是常使用的成骨细胞前体细胞系;来源于C2成肌细胞分离的亚克隆C2Cl2,是一种具有卫星细胞特性的成肌细胞,在BMP的作用下可以向成骨细胞分化;另外,还有目前研究的热点具有多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)和胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)。在OB中,转基因是通过借助成骨细胞特异性表达基因的启动子,如骨钙素基因和1型胶原的启动子来进行的。但这2种启动子在基因表达时空上不同,骨钙素基因启动子启动的基因倾向于在与骨内膜表面相连的成骨细胞及长骨骨基质的骨细胞上表达,而1型胶原的启动子启动的基因倾向于在成骨细胞、成牙质细胞和骨细胞上表达。凡与成骨细胞功能密切的基因均可借助于这2种启动子在成骨性谱系细胞上特异表达而研究其功能。HironoriHojo等建立了筛选抗OP小分子化合物诱导骨形成的成骨细胞转基因模型。成骨前体细胞系MC3T3E1以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的表达载体,稳定转染鼠1型胶原启动子2.3kb片段(Col1a1GFP-MC3T3E1)。通过BMP2刺激成骨分化。GFP荧光的强度与碱性磷酸酶密度以及降钙素的mRNA水平有很好的线性关系,通过测定OBGFP荧光强度与碱性磷酸酶密度以及降钙素的mRNA水平可以观察药物对OB的影响。3.1.3raskl和m-scf观察药物对OCTRAP阳性多核OC,OC融合指数抑制率、骨片吸收陷窝形成抑制率,骨片吸收陷窝形成抑制率以及OC数量和功能的生化检测。OC是一种“终末”细胞,目前世界上尚没有成功建立OC系。国外已利用RANKL联合M-SCF建立了体外诱导骨髓基质细胞或脾细胞分化为OC的培养方法。RANKL称为核因子ΚB活化受体的配体,属TNF超家族,在生理情况下,RANKL与OC前体细胞或OC表面的RANK受体结合,促进骨髓单核细胞分化为成熟的多核OC。M-SCF,巨噬细胞集落刺激因子,与OC前体细胞膜上M-CSF受体(cFms)结合,促进OC前体细胞增殖,但对成熟的OC无作用。利用RANKL和M-SCF直接诱导OC前体细胞或骨髓造血干细胞产生OC,提高可OC培养的数量和纯度,保证OC的来源丰富,为体外研究OC带来突破。RAW264.7细胞系是小鼠的单核/巨噬细胞系,来源于Abelson小鼠白血病病毒所致的肿瘤,被认为代表早期分化阶段的破骨前体细胞。利用RANKL和M-SCF诱导的RAW264.7细胞可获得抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性的多核细胞,不会受其他细胞的污染,可作为体外药物筛选的模型。3.1.4细胞培养支架材料近年来的研究发现,二维培养与三维培养的细胞在表型、细胞黏附、骨架组成、细胞迁移、信号转导、分化机制和药物应答等方面存在不同。产生这种差别在于体内细胞是在三维的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)中生长,而不是在玻璃或塑料平面上成长的。ECM不仅能提供表面供细胞黏附和迁移,而且作为细胞生长支架供外力作用,同时ECM为生长因子和外源性物质调节细胞分化和代谢功能提供外界环境。三维培养细胞通过紧密连接和缝隙连接等连接方式建立细胞间及细胞与胞外基质之间的联系,形成一定的三维结构。生物材料的发展使细胞培养支架材料更加接近ECM,模拟生物微环境。根据生物材料的不同,与OB有关的三维培养模型主要有海绵/凝胶、有机-无机纳米复合材料和自组装纳米多肽材料等。3.1.5同领域的工程化模型组织工程化模型是一种为体外构建与体内相似的培育环境和生物化学过程技术平台。在三维培养模型的基础上提供细胞生存的物理环境。近几年出现一些同领域的组织工程化模型用于药物筛选,HermanVandenburgh等将成肌细胞组织工程化而成为三维的肌肉,通过电刺激产生强直的作用力,并对这种三维肌肉施以平行作用力。这一平台将组织工程和生物力学检测整合,通过肌肉强度筛选低胆固醇抑制素类药物,一些中药单体可以应用组织工程化模型进行作用机制研究。3.1.6样品质量标准规范实验样品的统一性是中药研究十分重要也是困绕我国中药研究进步的大问题,无论是采用直接给药法还是间接给药法骨细胞培养实验,都应进行样品的质量标定或检测。所谓含药血清(血浆)也要测定药前和药后血清(血浆)是含原药成分还是含次生的代谢物成分,有许多研究者还分不清是含药血清还是含血浆,值得注意。3.1.7对照组的设计对照在研究中十分重要,实验应当设计空白、抗凝剂(如含药血清)、溶剂(助溶剂)以及阳性药物对照,阳性药物对照应当选择2种以上。3.1.8干扰因素的多体外细胞学实验结果判定一定要慎重,因为干扰因素多。特别是中药的一些提取物:如黄酮类(色素或与显色剂反应)、香豆素类(遇光变色)对比色法测定结果影响很大。3.1.9统计处理在骨细胞培养实验中也很重要,许多测定是半定量参数,许多文献报告中的统计不合理。大多数实验结果应当用