第7章亲和层析课件

第七章 亲和层析9/16/20231Affinity

chromatography技术背景9/16/20232一般纯化蛋白质、核酸等大分子物质的方法的主要依据是，各种大分子之间理化特性的差异性。如果这种差异性较小，要得到一种纯度稍

高的物质，常常需要进行多次繁琐的操作，耗费较长的时间，但最终收得率却是很低。9/16/20233内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例9/16/20234第一节 基本原理蛋白质2与配体无生物学特异性12L9/16/20235MS亲和层析的概念亲和力

根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.亲和层析法

利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。亲和层析法的实质

是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上的分子将以态洗脱下来。9纯/16/品202形369/16/20237亲和层析法的作用机理：固相载体(1)(2)(3)WashingElutionXBSampleB亲和基团配体XABAA9/16/202389/16/20239特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层析法：方法配体性能特异性配体亲和复杂的生命大分子具有较强的吸附选层析法物质（如抗体、受择性和较大的结合体和酶的类似底物力等）通用性配体亲和层析法9/16/2023简单的小分子物质（如金属、染料、以及氨基酸等）成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率

10亲和层析的特点：柱层析柱小

Vt＝1～1.5ml。上样量大,达

1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。操作简单,时间快速。柱子填充载体昂贵,配体的特异性,有时找不到适宜的配体,不适合所有生物大分子样品。条件温和:不影响样品的生物活性,适合生物大分子的操作。纯化效率高:一步法分离和

纯化混合物中的样品,提纯

达几千倍,得到高纯度样品。选择性强:依据生物学特异性,而非物理化学性质分离原理.故特异的层析图为2个峰,第1个为杂峰,第2峰9为/16/纯2023品。11Activity典型的亲和层析操作：Elution

volumeProteinpH2.05*9/16/202312亲和层析的特点：柱层析柱小

Vt＝1～1.5ml。上样量大,达

1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。操作简单,时间快速。柱子填充载体昂贵,配体的特异性,有时找不到适宜的配体,不适合所有生物大分子样品。条件温和:不影响样品的生物活性,适合生物大分子的操作纯化效率高:一步法分离和纯化混合物中的样品,提纯达几千倍,得到高纯度样品选择性强:依据生物学特异性,而非物理化学性质分离原理.故特异的层析图为2

个峰,第1个为杂峰,第2峰9为/16/纯2023品13内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例9/16/202314第二节 操作9/16/202315一、理想基质的性质结构是松散的多孔网络，利于大分子的流动与渗透；颗粒均匀的球形，刚性好,不易溶性，操作压的变化不引起变形；物理化学性质稳定；化学性质是惰性，以降低非特异性的吸附；带有丰富的化学基团易活化，以结合较多的配体；高度亲水性，易与水溶液中的生物大分子结合；抗微生物和酶的侵蚀。具有实用价值的基质纤维素：用于抗体与酶的纯化，如分离酪氨酸酶，酪氨酸酶的抑制剂连接到纤维素上，一步将酶纯化几百倍。

但其纤维性及非均一性限制了大分子的渗入;有非专一性吸附。葡聚糖凝胶：良好的化学及物理稳定性，多孔性的结构利于生物大分子的分离。但其膨胀度变化大，应用受限制。聚丙烯酰胺凝胶：物理化学性质稳定，抗微生物侵

蚀,可提供很多供化学反应的酰胺基，提高配基的浓度。适合于配基和亲和物之间亲和力较弱的系统。但9/16/不2023易引入间隔臂，受到限制。16其它实用性基质多孔玻璃：不受微生物的侵蚀，对有机溶剂和缓冲液的组成改变不敏感。保留表面含有羟基，在水溶液中显轻微负性的表面电荷，对酸性蛋白，病毒，多糖或核酸没有阻挡和吸附，而可以吸附所有的强碱性蛋白质和一些中性蛋白质及病毒。琼脂糖：商品为Sepharose

2B,4B,6B表示2，4和6％的琼脂糖浓度的珠状凝胶。其化学性质的稳定性弱于葡聚糖和聚丙烯酰胺，热稳定性差，在pH4－9的环境使用，在一定浓度的酸碱不导致凝胶颗粒的变化，不被有机溶剂（乙醇，丙酮）引起收缩，能经受高浓度变性剂而不9改/16/2变023其吸附性能，故实用性广。17二、配基（配体）的选择9/16/202318任何大分子或小分子蛋白、核酸（或其他分子）有特异结合的都可以作为配体；配体是有一定局限性，只能特异性地与某一种物质结合，而这种结合是可逆的，利用此性质可提取、纯化与配体特异结合的物质。1.配体的选择9/16/202319优良的配体必须具备两个条件：配体与生物大分子具有合适的亲和力;配体具有与载体牢固地结合,又不影响与生物大分子之间的亲和力。配体的选择固定在固相载体上的配体具有与目的蛋白能够选择性地结合并形成稳定复合物的能力。复合物的稳定性取决于配体与蛋白质结合位点之间结合的紧密程度。足够强的结合要求配体能够精确的嵌合在结合位点内。解离常数的范围在10-5～10-8/M时适合于亲和层析过程。当解离常数﹥10-3

时，配体与蛋白质的结合力较弱，在层析过程中拉不牢目的蛋白，选择性过低;当解离常数

＜10-15

时，亲和力太大，洗脱时得用激烈的和苛刻的、甚至是变性的条件。9/16/这2023对分离生物活性样品是忌讳的。202.配体的分类单特异性配体：只结合一个或很小数量的蛋白质，识别小分子的局限性强，甾体激素和酶抑制剂属于此类配体大分子单特异性配体：抗体－抗原结合是大分子单特异性配体及其目的蛋白的最重要的例证。组特异性配体（通用性配体）：是指一类像辅酶、维生素/辅因子或它们的类似物，它们可以同几种不同蛋白的共同位点相结合。是识别一类小分子物质的配体。大分子组特异性配体:是识别一类大分子物质的配体。凝集素和一些免疫球蛋白结合蛋白、伴刀豆球蛋白与糖蛋白结合等。9/16/2023

21专一性结合的生物体系常用配体分离对象酶蛋白基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等抗

体抗原、病毒、细胞外源凝集素多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白核

酸互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白激素及维生素受体、载体蛋白9细/16/2023胞细胞表面特异性蛋白、外源凝集素

22蛋白质亲和层析中的合适配体配体待纯化的蛋白质配体待纯化的蛋白质抗原特定单克隆抗体或多克隆抗体肝素凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、DNA聚合酶单克隆抗体特定抗原胆固醇胆固醇受体、胆固醇结合蛋白蛋白质A/蛋白质G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶核苷酸核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸盐糖蛋白三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素凝集素糖蛋白9抗/16生/20物23素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶239/16/202324三、亲和吸附剂的制备一般用CNBr衍生载体的功能基团，产生的亲电基团可以同配体的亲核基团（-NH2,-SH，－OH）反应。或者相反。用物理与化学的方法把配体偶联到基质上。化学偶联法是通过配体对活化的载体材料进行亲核攻击实现的.测定配体结合量，每mL或每g载体束缚配体的量mg（mg/mL）。一般用直接法和间接法测定。法载体的活化配体的偶联结合能力的测定9测/16/定202方325溴化氰（CNBr）环氧氯丙烷1,4-丁二醚戊二醛高碘酸盐9/16/202326活化剂种类常见几种活化剂的活化条件9/16/202327活化剂温度/℃pH值时间/min溴化氰41010-30环氧氯丙烷45-56131201,4-丁二醚5013120载体的偶联条件9/16/202328pH：最佳pH在8-10之间缓冲溶液：碳酸氢钠、硼酸盐，不能用Tris和其他含氨基的缓冲液温度和时间偶联配体浓度：每毫升凝胶选用配体1-20umoL不同活化剂活化载体的偶联条件9/16/202329活化载体温度/℃pH值时间/h溴化氰活化载体49.524环氧氯丙烷活化载体409.5241,4-丁二醚活化载体459.530用溴化氰活化载体9/16/2023309/16/202331四、特异性吸附欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合量较强时，配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密

的复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。

影响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有

关。例：P120复合物带9/16/202332样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除了与它们之间的亲和力有密切关系外，还与样品的pH值和离子强度有关系。9/16/202333五、层析步骤柱子再生结合步骤 装柱操作凝胶与配体偶联洗脱方法 淋洗9/16/202334样品制备选择配体流速控制柱子平衡洗脱目标样品1.样品制备9/16/202335除去颗粒、细胞碎片、膜片段等；样品的浓缩、除去蛋白酶及其抑制剂；可以通过盐析方法沉淀杂蛋白或离子交换层析法对样品进行预处理。2.结合吸附条件目标蛋白质对配体的特异性结合需要最适合的pH、缓冲液盐浓度、离子强度、温度。pH起着调节目标蛋白质分子以及配体分子的电荷基团性质的作用。中等盐浓度（0.1～0.15mol/L

NaCl）可以稳定溶液中的蛋白质并防止非特异性的作用。高盐浓度（2mol/L(NH4)2SO4）能特异性地提高配体和靶蛋白的疏水作用。EDTA(10mmol/L)用以稳定蛋白质中能被重金属

化氧化的－SH基。9/16/2023363.柱操作9/18/202337选用柱的大小依据a.吸附剂的容量；b.需要纯化的蛋白质的量。由于亲和原理，可分离的容量大。样品量可达柱体积。为提高分离效率，一般选用粗、短柱。总体积只需1～5ml。若靶蛋白是较低的结合常数﹥10-4/M可用较长的柱，结合较牢、结合常数＜10-13

/M则选用短柱。124.

柱流速的控制在概念上，亲和层析的流速比较快，要求不严格。但为了使纯化的蛋白质能得到尖的洗脱峰和最小的稀释度及最大的回收率。故上样品时使用低流速。太高的流速会降低分离效果和容量；用可溶性配体/类似物进行竞争性洗脱时，解离动力学可能成为速率限制；亲和柱的线性流速需进行优化达到最大的结合容量和最佳的分离。9/18/2023385.洗脱方法9/18/202339大体积的平衡缓冲液洗脱亲和力较小的分子；亲和力稍大时，线性梯度、阶梯分步洗脱；可改变pH、离子强度实现非特异性的竞争，解吸已结合的分子；对亲和力特别大的复合物，除用高浓度的可溶性配体洗脱外，还需6mol/L盐酸胍、pH1.5，使复合物在合理的时间内解离。并不破坏靶蛋白的天然构象及生物活性。以及洗脱后的除盐。①用NaCl梯度洗脱特异的静电作用结合的蛋白质；②疏水结合的复合物，加入乙二醇降低水溶液的极性；③9用/18/2变023性剂解离疏水结合的复合物。40A.特异性洗脱：9/18/202341凡是能与配体竞争酶的游离配体，都十分强烈地影响着结合酶的洗脱过程。游离配体浓度若与配体浓度相同，则可直接从基质上洗脱小结合的酶。同时应根据酶与配体亲和力的大小确定洗脱液的浓度。B.非特异性洗脱：通过改变洗脱液的条件（pH、离子强度、温度℃和介电常数），即能改变蛋白质的构象，降低蛋白质与配体的亲和力、不损害蛋白质与吸附剂的稳定性。6.洗脱步骤9/18/202342淋洗样品吸附上柱后，须用几倍体积的起始缓冲液淋洗柱子，去除所有不结合的物质，非特异性结合的成分可用稍微增加离子强度的条件除掉。洗脱为使靶蛋白在最小的体积内回收，其生物化学性质保持不变。基本方法是用中等浓度（0.2～1mol/L）的可溶性配体或类似物在温和条件下（中性pH）竞争性的结合蛋白。7.亲和层析柱的再生9/18/202343当洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二次亲和层析。一般亲和层析柱都可以反复使用多次。内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例9/18/202344第三节 提高吸附剂的操作容量9/18/202345亲和吸附剂的操作容量，受以下因素的影响：配体性质配体在吸附剂中的含量配体与吸附物结合时的位阻效应大小基质的多孔性操作条件等一、引入间隔手臂9/18/202346亲和层析中经常使用小分子化合物作为配体制备亲和吸附剂，但小分子配体直接连接于琼脂糖上产生无效吸附剂，其原因是由于载体的空间位阻关系，使大分子化合物（亲和物）不能直接接触到配体。因此，通过在载体与配体之间引入适当长度的“手臂”减少载体的空间位阻，增加配体的活动度。常见的间隔臂是6～8个碳原子的碳氢链，基质到配体的长度为0.5～1nm；或用长达17个碳原子。9/18/202347间隔臂:不同长度的间隔臂（B＝1nm）(C=2.1nm)对靶酶的亲和力的差异对氨基苯-β-硫代吡喃半乳糖苷9/18/202348氨乙基乙酰胺间隔臂的分类疏水间隔臂亲水间隔臂大分子间隔臂间隔臂与配体的偶联1.

亲核基团（氨基、硫醇、羟基）；亲电子基团（还亚胺碳酸、还氧乙烷、重氮盐、酚、芳香胺及活性羰基）。通用配体：腺嘌呤和核苷酸辅酶：用于纯化各种激酶、脱氢酶。多核苷酸：纯化与其亲和的蛋白质、酶、动物病毒和病毒的RNA序列及互补的聚核苷酸。辅酶：用于纯化亲和性的各种酶类。9/18/202349二、增加配体取代的程度基质的活性基团增多，配体结合量增加，操作容量亦大；由于位阻效应而影响配体的偶联量，故控制偶联反应的条件可增加配体的偶联数量。9/18/2023509/18/202351三、减少结合键增加配体与蛋白质的互补效应9/18/202352以蛋白质与多肽为配体时，以最少的共价键连接至载体，利于保护蛋白质的高级结构及生物活性；控制偶联反应的pH，减少蛋白质分子与基质连接的键；位点的减少，可以结合更多的蛋白质，提高结合容量。四、残留活化基团的封闭封闭多余的活化基团，避免非特异性吸附。结

论亲和层析一般采用柱层析方法；亲和柱的平衡缓冲液的组成、pH、离子强度；选择亲和物双方作用强，有利于形成络合物的条件；最紧密的络合物不容易解离，应考虑避开某些条件；选用近中性pH为亲和吸附条件，上样液与柱平衡液一致;避免生物大分子的失活，亲和吸附可在4℃进行；增加吸附容量，上样品速度尽量慢；用大量的平衡缓冲液洗去杂质，及非专一性的吸附，柱上保留专一的亲和样品；和力，使络合物完全解离。

9/18洗/202脱3液的条件与吸附条件相反，减弱配体与蛋白的亲53内容提要第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的操作容量第四节 应用实例9/18/202354第四节 应用A.不保留峰

B.脱附峰纵坐标示吸收值

横坐标示洗脱体积亲和层析的基础是对蛋白质进行选择性的吸附－

脱附，一般的结果是层析图谱上出现二个层析峰，不保留峰与脱附峰，脱附动力学一般较慢，脱附VeAB9/18/20的23

层析峰宽而拖尾。55亲和层析应用9/18/202356一、纯化特异性生物分子纯化抗原、抗体及其结合物；分离糖蛋白、各种凝集素；含巯基蛋白质的分离；用寡聚核苷酸分离核酸；凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。亲和吸附剂：基质－－间隔臂－－抗体(抗原)组成,用于鉴定、分离、纯化样品中的抗原(抗体)1.抗原、抗9/18/202357体的纯化Protein

A对IgG类物质有较大的束缚力，加之免疫球蛋白被束缚之后仍保留了IgG束缚抗原的特性。所以利用结合IgG的Protein

A-Sepharose

CL-4B吸附剂还可分离特异性的抗原。9/18/202358免疫亲和层析小鼠血清不同亚型IgG 的分离1m1的A蛋白Sepharose

CL-4B柱用1.5mol/L的甘氨酸-NaOH，pH

8.9的缓冲液(内含3mol／L

NaCl)平衡↓5m1小鼠血清同等体积的平衡液稀释后上柱↓洗去不吸附的蛋白质↓用不同pH的0.1mol/L柠檬酸洗脱9/18/202359

9/18/2023602.纯化糖类分子9/18/202361配体为外源凝集素的Sepharose6B的亲和层析介质，特异地结合碳水化合物的糖类残基或糖化细胞膜组分、细胞、亚细胞结构及糖蛋白等。凝集素和糖蛋白的亲和层析分离9/18/202362

凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。用10mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0，含0.15mol/LNaCl)平衡酸处理的Sepharose

6B(AT-6B)↓天花粉的丙酮粉制剂用平衡液抽提后，上AT-6B柱↓洗去不吸附的杂蛋白↓用0.2mol/L的半乳糖溶液洗脱花粉凝集素9/18/202363ⅰ.用含有半乳糖的天然多糖-琼脂糖的交联产物分离天花粉凝集素

9/18/202364ⅱ.糖蛋白亲和层析9/18/202365

不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。常用的凝集素

：

Con

A 、LCAWGA对甘露糖专一对N-乙酰氨基葡萄糖专一人血色素结合蛋白(hemopexin)的分离

用50m

mol/L的磷酸缓冲液，pH7.0(含0.2mol/LNaCl)平衡固定化的WGA柱离子交换层析得到含有血色素结合蛋白和转铁蛋白的级分↘↙上柱↓平衡液洗脱不结合在柱上的转铁蛋白↓含有100

mg／m1

N-乙酰氨基葡萄糖的平衡液洗脱血色素结合蛋白回收率达91％9/18/2023669/18/202367

UUUUUUUUUUUUUUUAAAAAAAAAAAAAAAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA带PolyU

(T)的亲和吸附剂分离含PolyA尾巴的mRNA3.分离核酸AAAAAAAAAAAAAAAAA9/18/2023689/18/202369SDS-PAGE4.以亲和层析法纯化

Trypsin：Disc-PAGEA

BC

=

DCHOMChitinTrypsinA

B

C&D以凝胶电泳鉴定亲和层析9/18/2操023作过程各步骤的样本→70酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析9/18/202371

一些酶及其抑制剂间存在着非常专一的相互作用。一些酶的抑制剂被固定化以后，就可用于一些酶的分离纯化。一些固定化的酶也被应用于蛋白类型的抑制剂的分离。

为了避免位阻现象，在酶类的小分子抑制剂固定化时，常要插入一些不同长度的“手臂”，如插入

8-9个原子。5.受体蛋白的纯化9/18/202372由于受体蛋白在激素与其互补的膜结合中的重要作用，同时其含量极低，使研究受阻。利用亲和层析法分离受体蛋白成为可能。例：胰岛素受体蛋白的纯化：将胰岛素偶联到溴化氰活化的琼脂糖凝胶，结合受体蛋白，特异性洗脱，释放出目标蛋白质。6.重组蛋白

用基因工程的方法引入特殊结合位点（如金属结合位点），将其加在重组目的蛋白的氨基端或羧基端。紧邻结合位点的位置加入蛋白酶切割位点，以便在用亲和层析纯化之后，将多余的蛋白质