固氮菌对小白菜种子萌发的影响及菌肥的筛选

固氮菌对小白菜种子萌发的影响及菌肥的筛选

目前，我国的肥料应用存在问题，表明化肥的使用结构不合理，重基肥、轻铵和微生物肥。尤其是长期不合理大量使用化肥导致诸如土壤肥力下降甚至退化以及作物抗病能力下降等问题。化肥的使用量最大是氮肥,由于施用技术粗放,甚少配方施肥,产能过剩达40%,导致农产品硝酸盐含量过高,不符合发展生态农业的要求,也无法实现有机种植[2,3]。虽然国家提倡多使用有机肥,一定程度上缓解了土壤污染问题和农作物品质问题,但有机肥不能改善土壤环境。在此背景下研发既能提高土壤肥力又能修复土壤生态系统的微生物肥料显得尤为必要,符合绿色种植的时代需求。微生物肥料又称菌肥,由功能菌与一定载体混合而制成,利用微生物自身的生命活动产生促进作物生长的物质,或将土壤中难溶的矿物质转化为作物可以利用的物质,从而增加肥效,或诱导作物抗病相关酶的活性,提高作物抗病力。按作用机理分,微生物肥料包括固氮菌肥(如自生固氮菌和联合固氮菌等),分解难溶矿物质菌肥(如解钾菌和解磷菌),生防菌肥(如枯草芽孢杆菌)等。其中固氮菌肥是最清洁、最经济的氮肥,不仅能降低环境污染,还能修复土壤生态环境,是发展可持续生态农业种植的需要。微生物肥料多以鸡粪等经腐熟的有机肥为载体,实现了将农家肥转化为微生物肥料,降低了环境污染,或用甘蔗渣、椰子皮堆沤处理作载体,变废为宝,都值得提倡。惠州有多家规模化生产食用菌的工厂,其下脚料菌糠多被当作废物丢弃,既浪费资源又污染环境,如何合理利用菌糠变废为宝成了一个重要的研究课题。本课题筛选高效固氮菌,用栽培金针菇的下脚料——菌糠为载体,接种固氮菌制备固氮菌肥,以菠菜、小白菜和空心菜为材料,从发芽率、株高、叶绿素含量、Vc含量等指标探讨固氮菌肥的肥效,以期为蔬菜绿色种植开发一种高效稳定价廉的微生物肥料。1材料和方法1.1培养基和试剂菌株固氮芽孢菌(Azotobactervinelandii),由本实验室分离鉴定并保种。菌糠由惠州富力达农业科技公司提供。试验用地惠州学院3号楼旁的空地,翻土三次改良成菜地。培养基及试剂:1LB培养基;2Ashby无氮培养基:甘露醇10.0g、CaCO35.0g、KH2PO40.2g、MgSO4.7H2O0.2g、NaCl0.2g、CaSO4.2H2O0.2g;(固体)琼脂15.0g;蒸馏水1000mL。上述培养基均用1mol/lNaOH和1mol/lHCl调节pH至7.0-7.2,液体培养基不加琼脂,121℃灭菌30min后备用。其他试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1菌株分离纯化及培养菌糠的处理自然风干,粉碎,经紫外灯照射1h。放置在干燥处保存备用。固氮菌肥的制作用Ashby无氮培养基对固氮菌进行分离纯化,扩大培养采用LB液体培养基。在恒温摇床28℃150r/min振荡培养到对数期,菌悬液在600nm波长下测定OD值(OD值>0.5可认为活菌数>108cfu/ml),按菌液:菌糠:无菌水为1:10:10的比例进行混匀,加薄膜覆盖,扎若干透气孔,约28℃堆肥4d使肥料腐熟,制备好的菌肥避光常温保存于阴凉处。1.2.2小球物理酶发芽试验(1)固氮菌肥各项指标检测有效活菌数和杂菌率的测定按照复合微生物肥料(NY/T7982004)中5.3.2的规定进行。除样品有效菌外,其他菌均为杂菌(包括霉菌)。杂菌率=杂菌数(/杂菌数+有效活菌数)×100%。(2)固氮菌肥肥效测试发芽率的测定将菌肥与无菌水按照1∶10的比例混合,200r/min振荡浸提1h,静置澄清后,将浸提液稀释制成不同体积分数(浸提液体积/稀释后体积),分别为100%、75%、50%和25%。将小白菜种子置于培养皿中,每份25粒,加入不同浓度的浸提液8mL。以无菌水为对照,每皿2个重复,于20℃暗培养进行发芽试验。分别在第3d、4d、5d、6d、7d计数发芽种子数,计算发芽率。种子发芽率=发芽的种子数/供检测的种子数*100%。蔬菜生长指标测量取菠菜和空心菜为材料,肥效试验分3个处理组:施固氮菌肥、施菌糠和空白对照,施肥方式选用沟施,即在植株间挖沟添肥再覆土,施用量约为500g。相同条件浇水。每个处理组种植蔬菜50株,随机选取10株分别测定株高、叶绿素含量和Vc含量。株高:从定植起每隔5d测量一次,每块地选取10株测量取平均值即为株高。叶绿素含量测定:取鲜绿叶片用双蒸水洗净吸干,去除叶脉,随机取样,准确称取0.50g放入研钵中,加入丙酮5mL,少许CaCO3和石英砂,研磨成均质。用丙酮重复洗两次研钵合并过滤,用丙酮定容滤液至20mL。以分光光度计分别测定663nm、645nm波长处吸光值,以丙酮做对照。计算叶绿素a、叶绿素b的含量和叶绿素总含量。维生素C含量测定:参照文献用2,6-二氯靛酚滴定法,略有改动。准确配制1mg/ml抗坏血酸标准溶液,标定2,6-二氯酚靛酚溶液至桃红色且15s内不褪色即为终点。称取新鲜菜叶5.0g,放入研钵中加少许2%草酸研磨至匀质,过滤成样品液。用标定过的2,6-二氯靛酚染液滴定至桃红色且15s不褪色为止,记下染液用量,重复3次,并以2%草酸做空白滴定对照。按公式计算维生素C含量。2结果与分析2.1菌肥指标检测结果根据中国农业部颁布的复合微生物肥料(NY/T798-2004)标准,颗粒微生物肥料需要符合以下技术要求,有效活菌数≥0.20亿/g,杂菌率≤30.0%,水分≤20.0%,pH值5.0-8.0。菌肥指标测量结果见表1。可知固氮菌肥在有效活菌数、杂菌率和pH值上都符合要求,水分含量21.3%,与标准水分20%相差不大,可认为本实验制备的固氮菌肥基本符合微生物肥料的技术要求。2.2不同浓度浸提液对种子萌发的影响种子发芽率可有效地评价肥料浸提液对植物生长有促进作用还是毒害作用。用小白菜的种子进行了发芽试验,由表2可见,浸提液浓度为25%时发芽率高于空白对照组,显示低浓度浸提液对种子发芽有促进作用。而较高浓度(75%、100%)时发芽率低于空白对照组,提示浸提液对种子有毒副作用。浓度为50%时发芽率与对照组差别不大,可能是促生作用与毒害作用相抵消的缘故。2.3固氮酶肥料对蔬菜生长的影响2.3.1施肥后第30d的结果对菠菜和空心菜的株高测量结果分别见图1和图2。图1可见前10d3个处理组的菠菜株高差异不大,第15d开始3个处理组的株高差异逐渐增大,施肥后第30d差异明显,菌肥组的株高比菌糠组和对照组分别平均提高了16.1%和49.3%,且P≤0.05,差异达显著水平。图2可见前15d3个处理组的空心菜株高差异不大,第20d开始3个处理组的株高差异逐渐增大,施肥后第30d差异明显,菌肥组的株高比菌糠组和对照组分别平均提高了31.2%和49.4%,且P≤0.05,组间差异达显著水平。2.3.2固氮菌肥对紫菜和空心菜叶片叶绿素含量的影响叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,是反映叶片生理活性变化的重要指标之一。由表3、4可知,施用固氮菌肥后菠菜和空心菜叶片叶绿素含量比菌糠组和对照组高,其中菌肥组的菠菜叶片叶绿素总含量比菌糠组和对照组分别提高了28.3%和34.5%,菌肥组的空心菜叶片叶绿素总含量比菌糠组和对照组分别提高了31.9%和45.7%。2.3.3两组紫菜vc含量比较3种处理对菠菜和空心菜Vc含量的测定结果见表5。可见菌肥组菠菜Vc含量远高于菌糠组和对照组,分别为22.8%和38.2%。菌肥组空心菜的Vc含量亦远高于菌糠组和对照组,分别为15.3%和35.9%。3测定指标和方法固氮菌肥的施用对作物的反应表现在生理、产量、品质、表观形态等诸多方面。因而,不能采用单一指标来评价,只有通过对多项指标的综合评价,才能客观地反映出固氮菌肥对作物的施用效果。本试验选用反映蔬菜生长发育的株高、叶绿素含量指标,以及反映蔬菜品质的Vc含量等多个指标,以期综合评定固氮菌肥对蔬菜种植的肥效。从结果看,固氮菌肥的施用促进了蔬菜的生长发育,使菠菜的株高、叶绿素含量和Vc含量等指标显著增加。本试验主要做了固氮菌肥对菠菜和空心菜的肥效试验,至于固氮菌肥对其它蔬菜的效果以及在生产实践中的